COX2和VEGF与肝癌多细胞球体群集耐药性的关系

    作者：姚煜,田涛,崔洁,赵娜　　作者单位：西安交通大学医学院附属医院肿瘤内科，陕西 西安


　　0引言

　　肿瘤细胞出现耐药现象是肿瘤化疗失败的主要原因之一. 三维细胞培养比平面细胞培养更能反映体内肿瘤的情况[1]. 我们检测肝癌多细胞球体(multicellular spheroids，MCS)对阿霉素(adriamycin，ADM)和5氟脲嘧啶(5fluorouracil，5FU)的耐药性以及环氧化酶2(cyclooxygenase2，COX2)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在肝癌群集耐药(multicellular resistance，MCR)中的表达的关系，探讨肝癌MCS的耐药机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料人肝癌HepG2细胞购自美国ATCC，由本室保存;RPMI 1640培养液购自Gibco公司;噻唑兰(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司;Annexin VFITC试剂盒购自晶美生物公司;COX2鼠抗人mAb和VEGF鼠抗人mAb购自Santa Cruz公司. 透射电镜(Hitachi，H600);扫描电镜(JEOL，JSM840);高通量多功能微板测试系统(BMG，PolarStar OPTIMA);流式细胞仪(BD，FALS Calibar);图像信号采集与分析系统(Leica，Q550CW). 细胞平面培养采用常规方法，多细胞球体采用liquid overlay技术获得[2]，先将20 g/L琼脂糖0.5 mL在6孔板上铺一薄层，冷却后接种HepG2细胞(1×106/L) 2 mL，每48 h半量换液1次，4 d后形成MCS.

　　1.2方法

　　1.2.1细胞超微结构观察取平面细胞和MCS，置于25 g/L戊二醛固定液中4℃固定2 h，10 g/L四氧化锇固定液4℃后固定2 h，乙醇梯度脱水，置换，切片，喷金后用透射电镜和扫描电镜观察.

　　1.2.2细胞抑制率的检测将细胞接种于96孔板中，在不同浓度ADM和5FU作用48 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，继续孵育4 h后弃上清，每孔加入150 μL DMSO振荡5 min，于492 nm波长处检测每孔A值，以不加药物组为空白对照，计算细胞抑制率. 细胞抑制率(%)=[(1-实验组A值)/对照组A值]×.

　　1.2.3细胞凋亡的检测单层细胞和MCS分别经不同浓度ADM和5FU作用48 h后收集，按照试剂盒说明书加入Annexin VFITC和PI，避光染色15 min后，上机检测细胞凋亡率.

　　1.2.4检测COX2和VEGF的表达单层细胞制作细胞爬片，40 g/L多聚甲醛固定20 min后备用. MCS 40 g/L多聚甲醛固定1 h后，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片后备用. 根据试剂盒说明进行免疫组化染色，阴性对照用PBS代替一抗. 用Leica Q550cw图像信号采集与分析系统在统一光强下随机选择10个视野(10×20)计算平均灰度值，灰度值越小，阳性染色越强，表明免疫反应性越高.

　　统计学处理: 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析. 计量指标以x±s表示，用COX2和VEGF的灰度值表示表达强度，组间比较用方差分析，P<0.05有统计学差异.

　　2结果

　　2.1单层细胞和MCS的形态学特点单层HepG2细胞贴壁生长，细胞表面有较多的微绒毛样突起，细胞间隙较大(图1A)，细胞间连接少见，仅见一类似紧密连接样的结构(图1B). MCS悬浮生长，细胞相互聚集并迅速增殖，形成细胞数目不等的球形多细胞聚集体，具有三维的结构特征，于培养后4 d直径达到200 μm左右(图1C)，细胞间黏附广泛而紧密，可见桥粒连接和中间连接(图1D).

　　2.2单层细胞和MCS细胞抑制率的比较MTT实验结果表明，除0.15625 mg/L组以外，经0.3125，0.625，1.25和2.5 mg/L的ADM作用48 h后，MCS的细胞抑制率低于单层细胞(P<0.05，图2A);经6.25，12.5，25，50和100 mg/L的5FU作用48 h后，MCS的细胞抑制率低于单层细胞(P<0.05，图2B).

　　2.3单层细胞和MCS细胞凋亡的比较经0.5，1.0，2.0 mg/L ADM作用48 h后，MCS的细胞凋亡率低于单层细胞(P<0.05，图3A);经40和80 mg/L 5FU作用48 h后，MCS的细胞凋亡率低于单层细胞(P<0.05，图3B). 在20 mg/L 5FU组两者的细胞凋亡未见明显差异.

　　A: 扫描电镜下单层细胞形态(×1000); B: 透射电镜下单层细胞形态(×3000); C: 扫描电镜下MCS形态(×370);D: 透射电镜下MCS形态(×60 000)

　　2.4COX2和VEGF的表达差异COX2和VEGF主要在胞质表达，呈棕黄色颗粒，对表达阳性的样本进行图像分析，测平均灰度值作为表达强度的量化指标. 将单层细胞培养成MCS时，COX2和VEGF的表达均增高(P<0.05)：单层细胞COX2的灰度值为190.8±9.4，MCS的平均灰度值为153.9±10.2;单层细胞VEGF的灰度值为207.4±8.8，MCS的灰度值为186.8±13.9. 光镜下观察，单层细胞COX2和VEGF仅个别细胞有弱的染色，而MCS大部分细胞有较强的染色(图4).

　　A: COX在单层细胞中的表达; B: COX在MCS中的表达; C: VEGF在单层细胞中的表达; D: VEGF在MCS中的表达.

　　图4COX2和VEGF在单层细胞和MCS中的表达×200

　　3讨论

　　肝癌耐药是影响化疗疗效和患者预后的重要原因. 尽管对于肿瘤耐药的研究，已经有了很大的进展，如MDR基因的发现，但是这些都是平面培养的结果，忽略了肿瘤细胞与细胞之间，细胞与基质之间的相互影响. 多细胞球体在组织结构上与实体瘤相似，体外培养简单方便，是研究实体瘤的良好模型，MCS的耐药现象已经在多种肿瘤中得到证实[3]. 本研究表明，将肝癌HepG2细胞三维培养，当细胞相互黏附成为较致密的多细胞球体时，细胞与细胞之间的连接结构明显增多，细胞间的相互作用增强;同时细胞抑制率、细胞凋亡率的检测提示其对ADM和5FU产生明显耐药. 这些说明我们所建立的肝癌群集耐药模型是成功的.

　　目前，已经提出许多机制来解释MCR[4]：①MCS中细胞具有不均质性，相对静止状态细胞的增多，使得对化疗敏感的细胞数量减少;②细胞间的黏附作用可以抑制细胞凋亡的发生，从而产生耐药;③MCS的环境引起的耐药相关基因的表达. COX2抑制剂可以通过激活死亡受体信号途径，caspase途径和线粒体途径诱导肝癌细胞凋亡[5].可见COX2的过度表达改变了细胞某些增殖和凋亡相关基因的表达，从而促进了肿瘤恶性行为的发生. Liu等[6]用CoCl2诱导几种前列腺癌细胞株VEGF表达的上调幅度与COX2的上调幅度基本一致，且选择性COX2抑制剂NS398可使VEGF的表达受抑，表明COX2的表达和VEGF相关. 研究表明，在白血病细胞中，VEGF可以诱导抗凋亡因子Bcl2的表达，从而抑制凋亡[7].

　　在本研究中，COX2和VEGF在MCS中的表达明显高于单层细胞，提示这可能是导致肝癌HepG2细胞MCR的重要原因之一. 当单层细胞黏附聚集成致密的多细胞球体时，细胞间连接的增多，MCS中心区缺氧的发生，环境因素的改变可能导致了COX2和VEGF表达的增加，从而促进了细胞增殖，抑制了细胞凋亡，参与了MCR的发生.