肝移植缺血再灌注损伤分子机制的研究进展

     作者：林峰,综述,傅志仁,审校　　作者单位：第二军医大学第二附属医院 全军器官移植研究所，上海 200003
     缺血再灌注引起肝脏损伤是一个连续不断的过程，并终导致肝细胞损伤[1]。这个过程是在肝脏短暂低氧并再氧合时触发，临床上许多情况下可发生肝脏缺血再灌注，例如肝脏低灌流状态，各种各样的外科手术操作以及移植中的供体器官切取。实际上肝脏缺血再灌注损伤是抗原成分获取的结果，是影响肝脏移植结果的重要因素。引起10%左右的早期移植后器官功能衰竭，并且急性和慢性排异的发生率较高[2-3]。此外，由于边缘性供肝对缺血再灌注非常敏感，这加剧了供体器官的短缺。因此减少缺血再灌注损伤能增加获得手术成功的患者数量。近年来，随着器官移植的迅速发展，器官保护有关的问题再次成为研究的热点，本文对相关文献作一综述，有助于对缺血再灌注损伤中复杂的分子基础有更好的了解。

　　1 肝脏缺血再灌注损伤的分子机制

　　1.1 细胞级联反应 肝脏缺血再灌注损伤的过程是许多相关因子联合作用产生级联反应导致后的肝脏功能衰竭。大量的证据证明Kupffer细胞、中性白细胞、内皮细胞以及反应性氧族在缺血再灌注损伤的发病机制中起了重要作用，这种相关的级联反应过程导致终结果是组织结构的改变并引起肝细胞功能的衰竭。在缺血肝脏再灌注后发生的组织病理学的改变包括细胞肿胀、空泡形成、内皮细胞破裂、中性粒细胞浸润。移植肝脏的冷缺血后再灌注肝脏组织的窦状隙内皮细胞凋亡和凝固性坏死明显增加[4]。微循环改变减少了肝脏灌流，在再灌注后48 h内达到高峰。受缺血再灌注打击后的肝脏结构的恢复需要2周的时间。

　　肝脏缺血再灌注损伤首先引起组织低氧妨碍了细胞间能量代谢和酶的功能，导致三磷酸腺苷耗竭、细胞内钠蓄积及细胞水肿。细胞在再灌注时的能量状态对于细胞的恢复是非常重要的。再灌注能复苏细胞，但是同时可以诱导进一步的损伤，再灌注后红细胞、中性粒细胞、血小板黏附到内皮细胞，并且肝脏窦状隙充血，导致微循环障碍[5]。缺血再灌注引起的肝脏内皮细胞反应是一个重要的级联反应诱发因素，同时内皮细胞是对肝脏缺血再灌注耐受性差的肝脏非实质细胞[6]。内皮细胞在缺血再灌注过程中被激活而表达一系列的表面黏附分子及MHC抗原，启动内皮组织和中性粒细胞间的相互作用。中性粒细胞的积蓄和活化加剧了微循环障碍并且移行进入损伤组织。一旦外渗和移行发生，中性粒细胞具有极强的破坏能力。这种可能通过整合素和细胞内黏附分子介导的两种分子的相互吸附，导致中性粒细胞诱发对肝细胞的损伤。中性粒细胞激活中毒性酶类例如弹性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，而且产生氧自由基[7]。Amersi等[8]报道重组体PSGL-Ig阻断中性粒细胞P选择蛋白间的相互作用能明显减轻鼠肝冷缺血后再灌注引起的肝细胞损伤。此外，采用rPSGL-Ig治疗能明显改善肝功能，降低髓过氧化物酶(MPO)活性，改善肝细胞损伤引起的主要组织学特征，减少移植物内单核细胞浸润及巨噬细胞/Th1型促炎症反应细胞因子的表达，从而减轻中性粒细胞在组织中的浸润。

　　Kupffer细胞是另一种与肝脏缺血再灌注损伤有关的非实质细胞，这种驻留型巨噬细胞可出现在肝脏的窦状隙内，肝Kupffer细胞在肝脏再灌注时被激活，产生一系列炎症性细胞因子(PGs，PAF，IL-1，TNF-α，IL-6，IFN-γ)和氧自由基，这些作为直接的细胞毒素作用于内皮细胞和肝细胞，导致肝脏损伤。

　　1.2 T细胞 以往推测随着缺血时间延长会使移植物更具有免疫原性，而且T细胞的免疫反应随之增强[9]。越来越多的证据表明T细胞在介导缺血再灌注引起的短期和长期损伤中起重要作用，这就能够解释为什么缺血再灌注会引起迟发性移植物功能丧失[10-11]。全身性免疫抑制剂(CsA，FK506)可减轻肝细胞缺血再灌注后损伤，提示T淋巴细胞参与了损伤的病理生理过程[12]。Shen等[13-14]发现T淋巴细胞缺陷小鼠肝脏缺血再灌注后损伤较对照组明显减轻。Kaudel等[15]发现给予FTY720治疗能阻断大鼠肾脏缺血再灌注损伤的发生，同时使大量外周血中的T细胞进入淋巴结后发生重新分布进入再循环。Khandoga等[16]发现在再灌注早期淋巴细胞在肝窦状隙发生附着并随着冷缺血时间的延长损伤肝脏功能。Moine等[17]发现抗炎症介质IL-10在缺血再灌注损伤过程中具有保护作用，不但与抑制Kupffer细胞释放细胞因子有关，而且与抑制T细胞驻留有关。所有这些研究结果与T细胞在缺血再灌注损伤机制中起主导作用相符合。然而，问题是T细胞在缺血再灌注损伤过程中是如何被激活的呢?实际上，Wiegard等[18]发现肝脏窦状隙内皮细胞(LSEC)表达抗原提呈(CD80/CD86、CD40)所需的分子，并且能够行使APCs对CD+和CD8+T细胞的提呈功能。肝脏窦状隙内皮细胞无需经过成熟就能获得APC的功能。此外，浸润肝脏的T细胞释放细胞因子、化学增活素及黏附分子，促使T细胞黏附到窦状隙内皮细胞。

　　1.3 氧自由基 氧自由基可能是缺血再灌注损伤组织中早出现和重要的成分之一。主要的氧自由基包括超氧游离基、羟基以及过氧化物。缺血肝脏氧自由基的主要来源是Kupffer细胞以及黏附的中性粒细胞[19]。氧自由基损伤蛋白、酶类、核酸、细胞骨架、细胞膜及脂质类超氧化物，导致线粒体功能下降和脂质类超氧化物减少[20]。氧自由基引起内皮细胞损伤导致微血管丧失完整性和血流量减少。内源性抗氧化复合物例如超氧化物歧化酶、过氧氢物酶、谷胱甘肽、维生素E和β-胡萝卜素等都具有抑制氧自由基的作用，但是这些成分可能很快被大量的氧自由基破坏[21]。有希望减轻氧自由基介导损伤的治疗方法可能是基因运载体。Zhou等[22]发现重组超氧化物腺病毒载体能明显减轻小鼠肝脏的缺血再灌注损伤。另外一种方法可能是通过将过氧化物掺入器官保存液为肝脏内皮细胞提供保护。

　　1.4 血红素氧合酶系统 血红素氧合酶是普遍存在的酶，在亚铁血红素分解为胆绿素、一氧化碳和自由铁的过程中起催化作用。氧化物对HO-1基因进行转录调控提示HO-1在氧化应激中参与了细胞保护机制[23]。此外，降低细胞内抗氧化物谷胱甘肽的浓度，会引起细胞内诱导HO-1基因的氧化物增加。这种HO-1的上调被认为是缺血后细胞应激的保护性反应。HO系统的激活在缺血再灌注触发的级联反应中可能提供了细胞保护功能。近年来的发现认为HO途径不仅抗氧化，而且是作为更加复杂的细胞保护和免疫调节系统[24-25]。

　　血红蛋白构成细胞外正铁血红蛋白的主要成分。红细胞是敏感的细胞之一，容易被氧自由基损伤。在缺血再灌注损伤中，红细胞变形并聚集，增加血液黏度和流动阻力。聚集的红细胞溶解后，释放亚铁血红素加重了氧化过程，产生损伤氧化膜的氧自由基和铁螯合物。缺血再灌注损伤中肝脏微血管紊乱的特征是再灌注后红细胞流速减慢，导致红细胞渗出和淤血，提示肝脏窦状隙内皮细胞的损伤。内皮细胞损伤的进一步的发展可能导致局灶性出血，肝细胞功能障碍以及后的器官功能衰竭。可以试用不同的方法改善这个过程以及缺血再灌注损伤：降低血管内血红蛋白水平，给予血凝酶在再灌注组织清除亚铁血红素，通过HO系统促进亚铁血红素的降解。

　　由亚铁血红素释放的CO可能在不同的细胞和生物学过程中作为一种调控分子，类似于NO。这两种物质可激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，引起平滑肌松弛，导致内皮组织血管舒张，这可能是CO介导的抗缺血再灌注损伤的细胞保护作用的机制。在灌注时CO通过抑制血管收缩维持微循环血流，减少缺血再灌注损伤相关的微血管血栓形成。CO在缺血再灌注损伤中的细胞保护作用其他的机制可能还有：抑制诱生型一氧化氮合酶(iNOS)，通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路下调某些炎症细胞因子，抑制内皮细胞凋亡。Kaizu等[26]发现大鼠肝移植中肝脏冷保存24 h后，以含有CO的血液活体外灌注2 h，与用不含CO的血液灌注相比门静脉阻力明显降低，胆汁量增加，肝脏功能改善，肝细胞损伤的组织病理学特征减轻。CO介导的细胞保护作用除了P38MAPK途径，还有iNOS和cGMP途径。此外，辅以HO-1竞争性抑制物锌原卟啉发现外源性CO能完全取代内源性HO-1抑制肝脏缺血再灌注损伤。因此，HO-1介导的细胞保护抗缺血再灌注损伤需要外源性CO的产生，并且完全能够被CO替代。

　　2 展望

　　供体器官的缺血再灌注损伤诱发两种明确的免疫防御系统：直接而广泛的宿主天然免疫防御系统以及宿主获得性免疫防御系统，后导致特异性器官损伤。实际上，缺血再灌注可能创造了一种炎症环境，在原位肝移植中作为“危险”信号，类似在感染性炎症中，通过激活宿主TLR受体启动了宿主天然免疫系统。激发的免疫反应可能引起可溶性硫酸类肝素蛋白多糖降解，通过树突状细胞上的TLR受体传递活化信号，问题是在肝脏缺血再灌注损伤中，自体损伤的细胞是否存在激活TLR受体系统的内源性物质。肝脏缺血再灌注中冷缺血主要影响窦状隙内皮细胞。通过内皮细胞代谢的透明质酸酶(hyaluronic acid，HA)被认为是肝脏内皮功能的可靠指标。因此，在缺血再灌注损伤中HA可能作为活化信号激活了Kupffer细胞上的TLR受体。相反，HO-1高表达可能抑制了HA，产生肝细胞保护作用。将来对HA-TLR关系的深入研究可能会对肝脏缺血再灌注损伤机制有更好的了解。此外，分子生物学的发展为通过基因治疗减轻肝缺血再灌注损伤提供了可能。有人研究利用腺病毒转染表达Bag-1和Bcl-2对凋亡的抑制作用。通过脂质体减少ICAM-1的表达则能减轻中性粒细胞聚集和活化[27]。另外，还可以通过腺病毒或脂质体片段表达血红素加氧酶-1(HO-1)、抗炎细胞因子白介素13(IL-13)和IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)达到细胞保护的目的。有研究利用腺病毒转染鼠κB-α突变体抑制剂来调节NF-κB效应，抑制NF-κB并减轻缺血再灌注炎性反应[28]。