RRM1在晚期非小细胞肺癌中的表达及其对吉西他滨+顺铂化疗效果的影响

　　作者：张献波,董英辉,胡跃云　　作者单位：河北省石家庄市医院肿瘤内科

　　【摘要】目的研究核糖核苷酸还原酶M1(RRM1)在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及与吉西他滨+顺铂化疗敏感性的关系。方法运用免疫组织化学 PV-9000二步法，检测30例初治ⅢB以上非小细胞肺癌患者中RRM1的表达与临床病理参数及与吉西他滨(简称GEM)+顺铂方案化疗敏感性，以及吉西他滨+顺铂化疗与临床病理参数的关系。结果非小细胞肺癌组织中RRM1的阳性率为56.67%，非小细胞肺癌组织中RRM1表达及吉西他滨+顺铂化疗疗效与患者的性别、年龄、吸烟、病理分型均未见相关性(P<0.05)。RRM1阳性者接受吉西他滨+顺铂的有效率低于RRM1阴性表达者，两者间的差异有统计学意义(P=0.035)。结论　RRM1的表达可作为非小细胞肺癌患者吉西他滨+顺铂方案化疗敏感性的指标之一，RRM1低表达患者从吉西他滨+顺铂方案化疗方案中获益。
　　【关键词】 肺肿瘤;核糖核苷酸还原酶;吉西他滨;免疫组织化学;敏感性，化疗

　　据统计，由于吸烟的流行，肺癌的发病率和病死率在发达国家和发展中国家相继迅速增高，1985年起肺癌已成为全世界常见的恶性肿瘤，2002年肺癌的发病率[1]和病死率均居恶性肿瘤的首位。随着全球工业污染和环境恶化，全世界肺癌新发病例有增无减。我国肺癌发病率在城市和农村总体上都在上升。吉西他滨是20世纪末研发的抗代谢类肿瘤药物，联合铂类是第三代化疗方案的一线治疗方案，美国东部协作组(ECOG)对 1 594例晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者用4种化疗方案进行多中心随机对照研究，发现301例用吉西他滨+顺铂有效率21%仅次于303例患者用顺铂+紫杉醇有效率21.3%，但是吉西他滨+顺铂的中位生存期、1年生存率及中位无病缓解期及化疗不良反应均优于顺铂+紫杉醇，所以吉西他滨联合顺铂是被的较优的化疗方案。但是目前多项研究表明，核糖核苷酸还原酶M1(RRM1)基因表达导致NSCLC患者对吉西他滨耐药，成为影响吉西他滨发挥佳化疗疗效大障碍[1,2]。本文旨在通过研究RRM1表达与吉西他滨的化疗疗效的关系及吉西他滨化疗与NSCLC患者病理因素的影响进一步研究。
　　1　资料与方法
　　1.1　一般资料
　　收集我院2006年至2009年收治的病理学诊断明确的ⅢB期以上的NSCLC初治患者30例;男20例，女10例;年龄44～73岁，中位年龄58岁;病理类型：鳞癌14例，腺癌8例，其他8例。按照国际抗癌联盟(UICC)1997年修订的肺癌分期标准分为：ⅢB期19例，Ⅳ期11例。按照患者是否有吸烟史：吸烟者21例，非吸烟者9例。所有患者均为初治，均接受2个周期以上的GP化疗方案(GEM 1 250 mg/m2，d1，d8，顺铂75 mg/m2，d2，肌内注射每3周重复1次)[1]。疗效评定：按照RECIST标准将治疗效果分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、病灶稳定(SD)、疾病进展(PD);CR、PR者为化疗有效(敏感组)，SD、PD者为化疗无效(耐药组)[3]。
　　1.2　试剂与方法
　　石蜡标本的切片厚度为4 μm，分别检测每位患者化疗前活检组织中核糖核苷酸还原酶M1(RRM1)的表达。采用PV-9000免疫组化二步法，山羊抗人RRM1单克隆抗体(编号10526-AP)购自武汉三鹰生物技术有限公司，PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒和氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自北京中山金桥生物技术有限公司。严格按照试剂盒的方法进行实验，用PBS代替一抗作阴性对照。
　　1.3　结果判定标准

　　RRM1蛋白在细胞质呈现清晰棕黄色颗粒的特异性免疫反应为阳性反应。每个病例由2位观察者采用盲法每个病例随机选择2个高倍视野，计数200个细胞，按照阳性细胞数占同类细胞数的比例，进行等级划分。阳性细胞数<25%计为 (-)、25%～50%计为(+)、51%～75%计为 (++)、>75%计为(+++)。
　　1.4　统计学分析
　　应用SPSS 16.0统计软件，计数资料采用χ2检验及 Fisher’s确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2　结果

　　2.1　RRM1蛋白在NSCLC患者化疗前的表达及与临床病理因素的关系

　　30例患者中RRM1(-)13例，RRM1(+～+++)17例。RRM1在男性和女性中的阳性表达率分别为52.38%、66.67%，差异无统计学意义(P=0.691)，RRM1在>58岁患者中和58岁患者中的阳性表达率分别为56.25%、57.14%，差异无统计学意义(P=0.961)。在有吸烟史的患者及无吸烟史患者的阳性表达率分别为61.90%、44.44%，差异无统计学意义(P=0.443)。RRM1在鳞癌、腺癌、其他病理分型中阳性表达分别为57.14%、50.00%、62.50%，三者差异无统计学意义(P=0.263)。见表1。表1　RRM1蛋白在NSCLC患者化疗前的表达及与临床病理因素的关系

　　2.2　RRM1与吉西他滨化疗敏感性的关系

　　RRM1阴性的有效率为61.54%(8/13)，RRM1阳性的有效率为23.53%(4/17),2组差异有统计学意义(P=0.035)。见表2。表2　RRM1与吉西他滨化疗敏感性的关系

　　2.3　吉西他滨敏感性与临床病理资料之间的关系
　　应用吉西他滨化疗后，男性患者的有效率和女性患者有效率分别为38.10%、44.44%，差异无统计学意义(P=1.000)。在>58岁患者和≤58岁患者的有效率分别为50.00%、28.57%，差异无统计学意义(P=0.232)。在有吸烟史患者和无吸烟史患者的有效率分别为33.33%、55.56%，差异无统计学意义(P=0.418)。在鳞癌、腺癌、其他病理分型中的有效率分别为55.56%、37.50%、50.00%，三者差异无统计学意义(P=0.521)。见表3。表3　吉西他滨敏感性与临床病理资料之间的关系
　　3　讨论

　　吉西他滨是嘧啶类抗代谢药物，属细胞周期特异性抗肿瘤药，主要作用于DNA合成期S期的细胞，在一定的条件下也可以阻止G期向S期的进展。它对核苷酸还原酶(ribonucleotidereduc-tase，RR)的活性有抑制作用。吉西他滨在细胞内经过核苷激酶的作用转化成具有活性的吉西他滨二磷酸核苷(dFdCDP)及吉西他滨三磷酸核苷(dFdCTP)，通过抑制DNA合成而发挥细胞毒作用[4]。RR是DNA合成通路中的限速酶，它能使二磷酸核苷酸转化为二磷酸脱氧核苷酸，后者是DNA合成和修复所必不可少的原料。RRMl是RR其中的一个亚单位，是核苷酸结合位点，控制底物的特异性和整个酶的活性，同时也是核苷类似物系的化疗药物的结合位点[5,6]。RRMl基因定位于染色体1 lql5.5区域，这是一个可出现于多种恶性肿瘤的杂合子丢失(10ss of heterozygosity，LOH)区域，称为LOHllA。该区域与恶性肿瘤的转移有关系[7]。
　　Oguri等[1]研究非小细胞细胞株H23/GEM-R发现RRMl高表达，用siRNA干扰RRMl的表达可以逆转其对Gem的耐药。Davidson等[2]在研究2个对Gem耐药的NSCLC细胞株时发现RRMl呈阳性表达，认为其可以作为预测Gem化疗敏感程度的生物标志物。Davidson等[8]研究证实RRM1高表达对吉西他滨耐药，对长春瑞滨或者紫杉醇等其他化疗药物不出现耐药现象。Bergman等[9]个建立吉西他滨耐药的体内模型，观察到应用吉西他滨耐药组RRM1明显增加，推测RRM1可能是后天获得的吉西他滨耐药的一个关键靶点。本研究采用免疫组化的方法对30例NSCLC患者病理标本进行检测，RRM1阴性患者的化疗有效率显著高于RRM1阳性患者化疗有效率，同时耐药组RRM1表达率显著高于敏感组的RRM1表达率，表明RRM1表达与吉西他滨耐药存在相关性，RRM1蛋白低表达NSCLC患者对吉西他滨化疗高度敏感。这与Resell等[10]对75例NSCLC患者肿瘤活检组织研究RRM1水平显示：低水平RRM1表达的患者在经过吉西他滨/顺铂联合化疗后会有一个更好的疗效的结论一致。而Bepler等[11]在一组Ⅱ期临床试验、接受吉西他滨/卡铂化疗的局部晚期NSCLC患者研究中，RRM1 RNA表达与肿瘤缩小程度负相关(r=-0.498，P=0.002);从另外的角度证实瘤内RRM1 RNA低表达患者化疗疗效好于高表达者。
　　目前，有研究还发现RRM1水平也会影响疾病进展和生存时间，有关吉西他滨/顺铂方案治疗晚期NSCLC的大规模临床随机对照试验中很明显的观察到，在吉西他滨/顺铂治疗的Ⅳ期非小细胞肺癌患者，RRM1的过度表达与生存期的显著缩短有独立相关性，但是在长春瑞滨/顺铂治疗组没有[10]。陈芹等[12]采用实时荧光定量PCR对NSCLC患者(I～Ⅲ期)瘤内RRM1 mRNA相对于管家基因的表达水平进行检测，结果示RRM1高表达组的生存期明显长于低表达组(P=0.045)。两研究结果表明RRM1表达对患者生存的影响在早期和晚期NSCLC起不同作用。RRM1作为DNA修复基因RRM1，是细胞内在DNA损伤修复能力的代表，因此某种程度上是显示瘤内累积性DNA损伤程度的生物标志。相对轻度基因损伤的细胞易于DNA损伤修复，广泛基因损伤的癌细胞易于逃避促凋亡监视，但是可以从吉西他滨化疗敏感中获益，更具有恶性表型和增殖，具体机制有待进一步研究。
　　在临床实际工作中，对NSCLC患者肿瘤组织进行免疫组化检测，比较容易实现，且成本低，但晚期NSCLC患者标本常不易取得，且很多穿刺标本量较少，无法进行基因组学检测。所以，在目前情况下，应用免疫组化方法进行RRM1表达水平的检测，具有现实意义。因此，临床上可将其作为吉西他滨/顺铂方案化疗敏感性及其预后的预测指标之一。