MT1MMP对人肝癌细胞株HepG2生物学行为的影响

　　作者：孟刚,张扬,蔺勇,王广义　　作者单位：吉林大学医院普外科，吉林 长春

　　【摘要】目的 观察膜型基质金属蛋白酶1(MT1MMP)对人肝癌细胞株HepG2生物学行为的影响。方法 将稳定表达MT1MMP基因转染至HepG2细胞中，应用RTPCR、Ⅰ型胶原黏附和Matrigel侵袭小室实验，检测细胞MT1MMP mRNA水平，体外黏附、侵袭和迁移能力的变化。结果 重组质粒转染株MT1MMP mRNA表达水平明显高于空质粒组和对照组(P<0.01)。MT1MMP明显提高细胞Ⅰ型胶原黏附、迁移和Matrigel侵袭能力(P<0.01)。结论 MT1MMP过表达可促进HepG2细胞体外侵袭和转移，提示其可作为人肝癌抗侵袭治疗的分子靶点。
　　【关键词】 膜型基质金属蛋白酶1;肝细胞癌;侵袭

　　Effects of MT1MMP on biological behavour of human hepatocellular carcinoma cells HepG2

　　MENG Gang, ZHANG Yang, LIN Yong , et al.

　　Department of General Surgery, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China

　　【Abstract】ob[x]jective To observe the effects of membrane type1 matrix me[x]talloproteinase (MT1MMP) on biological behavour of human hepatocellular carcinoma (HCC) cells HepG2.Methods HepG2 with overex[x]pression of MT1MMP were established by stable transfection. MT1MMP mRNA level was examined by RTPCR. Cells was analyzed in invasion ability by invasion chamber coated with Matrigel, adhesion towards collagen Ⅰ and migration through culture chamber. Results MT1MMP mRNA level of HepG2 cells that transfected with the recombinant vector was obviously higher than that of empty vector group and that of control group (P<0.01). MT1MMP could enhance cell invasion through Matrigel, adhesion towards collagen Ⅰ and cell migration. Conclusions MT1MMP overex[x]pression could enhance HepG2 cells invasion and migration in vitro, suggesting that MT1MMP may be a proper molecular target of antiinvasion therapy for HCC.

　　【Key words】 MT1MMP; Hepatocellular carcinoma; Invasion

　　基质金属蛋白酶(MMPs)在肿瘤生长、浸润和转移等多个环节中起到重要的作用。膜型MMP1(MT1MMP)是新近发现的一个肿瘤转移相关基因，其表达增高与卵巢癌、胃癌、结直肠癌、喉癌等的侵袭转移能力呈正相关〔1〕。本研究通过观察肝癌细胞株HepG2转染MT1MMP全长基因后黏附、侵袭和迁移能力的改变，探讨MT1MMP表达与肝癌侵袭转移的相关性。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料

　　人肝癌细胞株HepG2和pcDNA3.1/MT1MMP真核表达质粒由吉林大学医院中心实验室保存;脂质体Lipofectamine2000、Trizol及G418均购自Invitrogen公司;DMEM培养基和胎牛血清为Gibco产品;RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司;PCR引物由上海生工公司合成;Ⅰ型胶原和Matrigel购自BD公司。
　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞转染和筛选培养
　　取对数生长期HepG2细胞重悬于DMEM培养液中，以4×105个细胞/孔接种于6孔板中，培养24 h，使细胞达到60%～70%融合。按Lipofectamine2000试剂盒说明转染空质粒(空质粒组)和重组质粒(MT1MMP)，并设未转染组。转染48 h后换液，加800 g/L G418进行筛选，4 w后未转染组细胞全部死亡，G418浓度调至250 g/L继续筛选。分离抗G418阳性克隆，用选择培养液扩大培养。
　　1.2.2 逆转录
　　聚合酶链反应(RTPCR) Trizol一步法提取总RNA，紫外分光光度法检测浓度和纯度。取5 μg总RNA，AMV逆转录酶进行反转录。取cDNA 10 μl作PCR扩增MT1MMP，同法以βactin作为内参照。MT1MMP引物序列为：上游引物：5′CAACACTGCCTACGAGAGGA3′;下游引物：5′GTTCTACCTTCAGCTTCTGG3′，PCR反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，扩增30个循环，72 ℃延伸5 min。扩增片段长度为380 bp。βactin引物序列为：上游引物：5′GTTTGAGACCTTCAACACCCC3′;下游引物：5′GTGGCCATCTCTCTTGCTCGAAGTC3′，扩增片段长度为320 bp。取5 μl PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察、拍照。细胞MT1MMP表达水平以MT1MMP/βactin积光分光度比值表示。
　　1.2.3 细胞体外黏附实验

　　收集对数生长期细胞，制备单细胞悬液，调整各组细胞密度为1.0×105个/ml。分别以每孔100 μl接种于覆以Ⅰ型胶原的96孔培养板中，每组设8个复孔，温育1 h。PBS洗去未黏附细胞，采用MTT法，酶标仪检测540 nm处的吸光度(A540)。实验重复3次。
　　1.2.4 细胞体外侵袭实验和迁移实验
　　8 μm的硝酸纤维素微孔滤膜上均匀涂上Matrigel(1∶5稀释)，37℃放置3 h备用。向Boyden小室的上室中加入细胞悬液25 μl，下室各孔加入25 μl无血清培养24 h的NIH3T3细胞上清液。每孔设3个复孔，常规培养24 h，取出膜，用棉签拭去膜上室面细胞，70%甲醛室温固定45 min，HE染色后，在倒置显微镜下随机选取10个200倍视野，计数穿膜细胞数目，取均值。实验重复3次。迁移实验：不铺Matrigel胶，其余步骤同侵袭实验。
　　1.3 统计学方法
　　数据以x±s表示，采用SPSS10.0软件进行组间t检验。
　　2 结 果
　　2.1 稳定表达株的筛选与比较

　　将pcDNA3.1/MT1MMP质粒转染HepG2细胞，经4 w选择性培养(250 g/L G418)后，得到了稳定表达目的基因的阳性细胞株。经半定量RTPCR法分析显示，重组质粒转染组细胞MT1MMP表达量(3.66)与未转染组(1.19)有显著差异(P<0.01);空质粒转染组细胞MT1MMP表达量(1.21)与未转染组(1.19)无显著差异(P>0.05，图1)。
　　2.2 细胞体外黏附能力的比较
　　转染MT1MMP组A540为(0.29±0.03)，其黏附Ⅰ型胶原的能力明显强于空质粒组(0.12±0.02)和未转染对照组(0.11±0.01)(P<0.05)。
　　2.3 细胞体外侵袭和迁移能力的比较

　　转染MT1MMP组的视野内平均细胞数为(103.7±16.5)个，其侵袭和穿透Matrigel的能力较转染空质粒组〔(41.3±13.1)个〕和未转染对照组〔(38.5±11.7)个〕明显增强(P<0.01)。细胞体外迁移实验中，重组质粒组、空质粒组和未转染对照组穿膜细胞均数分别为(87.4±6.6)个、(38.2±3.1)个和(36.7±2.8)个，重组质粒组与后两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。
　　3 讨论

　　MT1MMP是Sato等〔2〕应用分子生物学技术，从肺癌细胞筛选克隆出的肿瘤转移相关基因。此后人类多种恶性肿瘤中的MT1MMP mRNA表达与侵袭转移密切相关的报道，亦说明MT1MMP基因是肿瘤浸润和转移的关键分子之一。
　　在生物学行为上，肝癌细胞株MHCC97H和HCCLM3为高转移，而HepG2、Hep3B、HuH7、BEL7402和SMCC7721则为低转移。Blanc等〔3〕发现，低转移性肝癌细胞株表达MT1MMP水平较低。因此，本实验选取HepG2细胞作为研究对象。将MT1MMP转染至HepG2细胞株中后，观察到细胞体外黏附、侵袭和迁移能力均增强。这与Sodek等〔4〕和Petrella等〔5〕分别在卵巢癌和转移性肾细胞癌中的报道一致。另外，研究人员观察逆转录病毒载体介导MT1MMP 基因对乳腺癌细胞株MDAMB231生物行为影响，发现MT1MMP mRNA水平和细胞体外侵袭能力均有所下降，而且对侵袭刺激物肝细胞生长因子(HGF)反应力下降，但细胞生长速度变化不大〔6〕，提示MT1MMP基因可作为一个肿瘤转移相关基因。
　　关于MT1MMP基因促进肿瘤侵袭和转移的分子机制有三点推测：①MT1MMP能有效地降解ECM成分，如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原、纤连蛋白(fibronectin)、层黏连蛋白(laminin)、纤维蛋白(fibrin)和蛋白聚糖(proteoglycan)等〔2〕;②MT1MMP通过触发MMP2酶原〔1〕和MMP13酶原〔7〕等级联激活反应，引起ECM的降解;③MT1MMP能分解细胞表面受体——整合素αVβ3〔8〕和细胞黏附分子CD44〔9〕，使细胞黏附性发生改变，促进肿瘤细胞迁移。
　　我们在前期工作的基础上，将能表达全长MT1MMP cDNA的真核表达质粒转染到肝癌细胞株HepG2中，并通过筛选获得稳定表达MT1MMP的细胞克隆。通过对该克隆黏附、侵袭和迁移能力的检测，证实MT1MMP对细胞转移潜能的作用。因此，MT1MMP有可能成为靶向抑制肝癌的分子靶点。
　　【参考文献】
　　1 Seiki M. Membranetype 1 matrix me[x]talloproteinase: a key enzyme for tumor invasion〔J〕. Cancer Lett, 2003;194(1):111.

　　2 Sato H, Okada Y, Seiki M. Membrane type1 matrix me[x]talloproteinase(MTMMPs) in cell invasion〔J〕. Thromb Haemost，1997;78(1)：497500.

　　3 Blanc JF，Bisson C，Frankenne F，et al. Hepatocarcinoma cell lines downregulate matrix me[x]talloproteinase2 ex[x]pression in human hepatic myofibroblasts〔J〕. Int J Oncol，2002;20(6)：112936.

　　4 Sodek KL，Ringuette MJ，Brown TJ. MT1MMP is the critical determinant of matrix degradation and invasion by ovarian cancer cells〔J〕. Br J Cancer，2007;97(3)：35867.

　　5 Petrella BL，Brinckerhoff CE. Tumor cell invasion of von Hippel Lindau renal cell carcinoma cells is mediated by membrane type1 matrix me[x]talloproteinase〔J〕. Mol Cancer，2006;5：66.

　　6 Jiang WG，Davies G，Martin TA，et al. ex[x]pression of membrane type1 matrix me[x]talloproteinase，MT1MMP in human breast cancer and its impact on invasiveness of breast cancer cells〔J〕. Int J Mol Med，2006;17(4)：58390.

　　7 Knauper V，LopezOtin C，Smith B，et al. Biochemical characterization of human collagenase3〔J〕. J Biol Chem，1996;271(3)：154450.

　　8 Baciu PC，Suleiman EA，Deryugina EI，et al. Membrane type1 matrix me[x]talloproteinase(MT1MMP) processing of proalphav integrin regulates crosstalk between alphavbeta3 and alpha2beta1 integrins in breast carcinoma cells〔J〕. Exp Cell Res，2003;291(1)：16775.

　　9 Kajita M，Itoh Y，Chiba T，et al. Membrane type1 matrix me[x]talloproteinase cleaves CD44 and promotes cell migration〔J〕. J Cell Biol，2001;153(5)：893904.