结核杆菌PEPCK免疫作用的初步研究

　作者：柏雪莲,王志强,刁兴华,张珍,刘春会　　作者单位：1 滨州医学院病原生物学教研室 滨州市 256603;2 滨州医学院附属医院
　　【摘要】目的 初步研究结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(PEPCK)的免疫作用。方法 用敲除pckA基因的卡介苗(BCG△pckA)和野生型卡介苗(BCGWT)分别感染小鼠，取肺脏进行病理分析;取脾脏用流式细胞仪检测CD4+ 、CD8+T细胞、CD4+/CD8+，酶联免疫吸附试验检测IL12;取脾脏进行结核杆菌的培养，比较两组菌落数量。结果 BCG△pckA感染的小鼠比BCGWT感染的小鼠肺脏内产生的结核结节少且不典型，炎性程度低;BCGWT感染的小鼠脾脏内的CD4+T 细胞和CD4+/CD8+及IL12滴度明显高于BCG△pckA感染的小鼠;BCG△pckA株形成菌落的数量明显低于BCGWT株形成菌落的数量。结论 pckA基因为结核杆菌生长所必需，其编码产物PEPCK能够刺激机体产生免疫反应，可能是一种很好的疫苗候选分子。
　　【关键词】 结核杆菌; pckA基因;磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶;免疫保护

　　The primary research on phosphoenolpyruvate carboxykinase immune effect of mycobacterium tuberculosis

　　BAI Xuelian WANG Zhiqiang DIAO Xinghua et al

　　Department of Parasitology and Biology, Binzhou Medical University, Binzhou 256603

　　【Abstract】 ob[x]jective To research the immune effect of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) of mycobacterium tuberculosis.Methods Mice were infected with wild type BCG and pckA mutated BCG respectively. The lung histology of infected mice was checked.The number of CD4+ and CD8+ T cells，CD4+/CD8+ were assayed by flow cytometry.Interleukin12 was detected by ELISA. BCG from spleens of two groups of mice was cultured and the number of CFU was taken count.Results Granulomas in pckA mutated BCG (BCG△pckA) infected mice were fewer and more atypical than those in mice infected with wild type (BCGWT). The number of CD4+ T cells and the ratio of CD4+/CD8+ from the BCGWT group were significantly higher than those form BCG△pckA group. The titer of interleukin12 of BCGWT infected mice was higher that that of BCG△pckA group. And the number of BCG CFU from BCGWT group was more than that of BCG△pckA group.Conclusion pckA gene is necessary for the growth of mycobacterium tuberculosis. PEPCK can effectively induce immune responses and can be a good candidate for vaccine.

　　【Key words】 mycobacterium tuberculosis, pckA gene, phosphoenolpyruvate carboxykinase, immune protection

　　结核病是由结核杆菌感染所致的慢性传染病。世界上约有1/3的人感染结核[1]。现在使用的预防结核的卡介苗，保护作用从0%～80%不等，很不稳定。另外，现在由于药物的应用，多种药物抗性结核分枝杆菌已产生。所以寻找既可作为抗结核的疫苗，又可作为抗结核药靶的候选分子是当今研究的热点。基因组分析发现，结核杆菌含有pckA基因，其编码72 kD的磷酸烯醇型丙酮酸羧基酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)，催化草酰乙酸和磷酸烯醇型丙酮酸之间的可逆性反应。PEPCK在结核致病和诱导机体免疫中可能起重要作用。本研究用敲除pckA基因的牛结核菌BCG感染小鼠，观察引起肺的病理变化和对淋巴细胞、细胞因子产生的影响，并检测了BCG在体内的生长情况;初步研究了结核杆菌pckA基因编码的PEPCK对结核杆菌生长的重要性及其免疫保护作用，为进一步研究提供了依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 主要试剂及仪器 RPMI 1640培养液购于SCIENCE生物公司，HE和耐酸染剂购于上海市试剂工贸有限公司。检测细胞因子的单抗为美国BD PMG公司产品，碱性磷酸酶标记的兔抗大鼠IgG结合物为美国Sigma公司产品。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠IgG2a、藻红蛋白(PE)标记的IgG2a及两者的同型对照为美国BD公司产品。FC500型流式细胞仪购于美国BECKMANCOULTER 公司，旋转薄片切片机为上海申安医药器械公司产品。
　　1.2 菌株 野生型牛结核杆菌(BCGWT)及敲除pckA基因的牛结核杆菌(BCG△pckA)由美国哈佛大学公共卫生学院提供。
　　1.3 实验动物 BALB/c小鼠，体质量18～22 g,购于山东大学医学院实验动物中心。
　　1.4 实验方法

　　1.4.1 BCGWT和BCG△pckA感染小鼠：选雌性BALB/c小鼠。将BCGWT和BCG△pckA培养至OD600为0.8，用含0.01%吐温80的PBS洗涤、混匀。将细菌浓度调整到1×107个/ml, 每只小鼠尾静脉注射0.1 ml菌液, 即1×106个细菌。PBS吐温80对照组每只小鼠尾静脉注射 0.1 ml。间隔一定的时间处死小鼠，取脾脏，研成1 mm大小的碎块，在1 ml PBST中搅碎混匀。用PBS将悬液稀释，取100 μl铺板并计算BCG的菌落数。用于测定T细胞时，小鼠每2周感染1次，共感染3次。
　　1.4.2 组织学检查：取小鼠左侧肺，用10%PBS福尔马林浸泡24 h。用乙醇逐级脱水，石蜡包埋。用旋转薄片切片机对包埋块的三个断面进行切片，厚度为100 μm, 用HE和耐酸染剂进行染色，显微镜下进行观察。
　　1.4.3 淋巴细胞的检测：将第3次感染后14 d的小鼠，无菌取脾，在含有RPMI 1640培养液的平皿中，用针栓平端轻微挤压研磨，收集细胞悬液，然后加红细胞裂解液，离心，将沉淀重悬于RPMI 1640培养液中，计数并将浓度调致5×106/ml ，用流式细胞仪(滨州医学院附属医院中心实验室)进行测定。
　　1.4.4 细胞因子的检测：将以上收集的脾细胞悬液浓度调致6.4 ×107/ml 。将该细胞悬液分别滴入96孔无菌细胞培养板中，每孔0.2 ml，培养3 d后，收集上清。取培养液上清包被96孔反应板，常规ELISA法检测。
　　1.5 统计学方法 采用SPSS10.0统计分析软件进行分析。
　　2 结果

　　2.1 pckA基因缺失所致的病理变化 病理学研究发现，在BCGWT和BCG△pckA株感染6 h后肺脏没有明显的组织学上的变化。在感染后20 d，肺脏检查显示，BCGWT感染的小鼠出现清楚的结核结节，结节中含有巨噬细胞、上皮样细胞、中性白细胞和淋巴细胞，有周围小血管和周围小淋巴管积聚。而BCG△pckA感染鼠体内的结节不如野生型BCG感染鼠典型，并且数量少，炎性程度低(图1)。
　　2.2 pckA基因对淋巴细胞增殖的影响 用BCG△pckA、BCGWT分别感染小鼠，PBS吐温80做对照，第三次感染2周后，取小鼠脾脏，用流式细胞仪检测T细胞，结果见表1。表1 小鼠脾脏淋巴细胞检测结

　　2.3 pckA基因对细胞因子的影响 用BCG△pckA、BCGWT分别感染小鼠，PBS吐温80做对照，第三次感染2周后，取小鼠脾脏进行培养，取培养液上清，用ELISA法检测细胞因子IL12，结果见表2。表2 小鼠脾细胞培养上清中IL12细胞因子检测结果注：与对照组比较，* P<0.05

　　2.4 用BCGWT株和 BCG△pckA株感染BALB/c小鼠，取脾脏进行结核杆菌的培养，结果显示，由第14天开始，BCG△pckA株形成菌落的数量明显低于BCG野生型株形成菌落的数量(P<0.01，表3)。
　　表3 每毫升脾细胞悬液培养菌落数对数结果(x±s)组别4 d10 d20 d35 d56 dBCGWT4.9±0.215.3±0.194.7±0.254.8±0.174.6±0.15BCG△pckA4.7±0.155.1±0.164.4±0.224.2±0.234.2±0.25

　　3 讨论

　　结核是由结核杆菌引起的对人类健康威胁很大的一种慢性疾病。由于以往所用的卡介苗对人类的保护作用很不稳定，所以现在人们需要寻找新的更好的抗结核疫苗或药物的靶点。本研究用BCGWT感染的小鼠肺脏内产生明显的结核结节，而用BCG△pckA感染的小鼠体内产生的结节不典型且数量少，炎性程度低。结核结节是结核杆菌感染的主要特征性免疫病理变化，是机体产生有效保护性免疫反应的表现。结核结节的结构内层为被包裹的结核菌，再外层为中性粒细胞、类上皮细胞、淋巴细胞，外层为纤维母细胞形成的纤维层。结核结节的形成把结核菌包裹起来，对于防止其扩散起到很重要的作用。由此可知，pckA基因编码的PEPCK能够有效的刺激机体产生结核结节，对机体产生保护作用。
　　结核杆菌寄生在巨噬细胞内，是引起机体产生细胞免疫反应的主要病原体。本实验中用BCGWT感染后，小鼠CD4+T细胞、CD4+/CD8+均明显的高于用BCG△pckA感染的小鼠，即pckA基因产物能够刺激CD4+T细胞增多、活化。CD4+T细胞是介导细胞免疫反应的主要细胞，也被认为是抗结核感染的主要细胞[2，3]，尤其是Th1细胞在抗结核的免疫反应中起到很重要的作用。有人检测发现结核感染时CD4+T细胞向肺部聚集[4，5]。 CD4+T细胞的增多表明细胞免疫的增强,对结核杆菌的杀伤作用增强。本研究中用BCGWT感染的小鼠体内产生的IL12明显高于BCG△pckA组。IL12在抗结核的免疫反应中起到很重要的作用，IL12能够诱导IFNγ的产生，抑制IL4的产生，调节1型细胞因子和2型细胞因子之间的平衡，这对于幼稚性T细胞向Th1分化是十分重要的[6]。IL12也是NK细胞和T细胞的激活剂，尤其对NK细胞激活作用显著。乳铁蛋白能够通过提高IL12/ IL10的比率增加IL12的产生[7]。Feng等[8]研究发现IL12 p40缺陷的小鼠在开始时表现出抑制结核菌的生长，延长生存天数，但后不可避免的感染上结核，这表明IL12的产生对于维持肺内Th1细胞的数量是必需的，阻断IL12的产生会造成疾病复发。人类如果IL12基因缺陷也表现出对散在BCG的易感性[9]。本研究还取分别用BCGWT和 BCG△pckA感染的小鼠脾脏进行结核杆菌的培养，发现由第14天开始，BCG△pckA株形成菌落的数量明显低于BCG野生型株形成菌落的数量，这与机体产生免疫反应的时间相符，表明PEPCK可保护细菌免受宿主的杀伤。
　　综上所述，pckA基因是结核杆菌的重要基因，为结核杆菌生长所必需， 其产物即磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(PEPCK)能够刺激机体产生保护性细胞因子，活化CD4+T细胞，从而有效的诱导机体产生细胞免疫应答。可见PEPCK是一种很好的疫苗或者抗结核药靶候选分子。
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