生物膜的保护剂海藻糖在冻干红细胞中的应用

　作者：庄远,刘景汉　　作者单位：解放军总医院输血科 全军临床输血中心，北京 100853

　　【摘要】 海藻糖作为一种稳定的非还原性双糖，在细胞冷冻、干燥、冻干过程中对细胞活性有着良好的保护作用并已广泛应用于人血细胞的冻干。海藻糖以其异常的水合能力、独特的玻璃化转换和晶体转变行为及抗高温潮湿的特性受到密切关注，并成为细胞保存研究中的一种保护剂。海藻糖对细胞的保护机制、海藻糖导入哺乳细胞的实验方法以及红细胞对海藻糖负载的可能作用机制都是近几年细胞保存研究的热点，本文就以上几方面的进展详细进行论述。
　　【关键词】 生物膜保护剂;海藻糖; 冻干保存; 红细胞
　　Trehalose —A Biomembrane Protectant Applyied to Lyophilization of Human Red Blood Cells——Review

　　ZHUANG Yuan， LIU Jing-Han

　　Department of Blood Transfusion, General Hospital of PLA, Military Clinical Transfusion Research Center, Beijing 100853, China

　　AbstractTrehalose, as a nonreducing disaccharide, plays a role in protecting the cytoactivity when the cells is freezing, drying or lyophilization. It has been a biomembrane protectant applied to lyophilization of human blood cells (platelets and erythrocytes), and from which astonishing results have been obtained. Having powerful hydration, distinctive vitrification transform and crystal transform and unique resistance of high temperature and humidification, trehalose is thought of a preferred protectant in the study of cell preservation. In recent years, people concerned trehalose on its protective mechanism, experimental means of transit trehalose to mammal cells and the mechanism of loading in red blood cells. The above aspects were briefly summarized in this article.

　　Key wordstrehalose; vitrification; lyophilization; erythocyte

　　海藻糖作为一种稳定的非还原性双糖，在一些微生物、低湿休眠脊椎动物和更苏植物中有较高的浓度。当这些生物处于干燥脱水或高渗环境时，海藻糖可以在细胞膜外形成一种玻璃状的防护层，提高了细胞的渗透压耐受性或耐干燥性，从而在干燥状态下保护生物体细胞内的蛋白质、脂类、糖类、核酸等组分不受破坏，使细胞继续保持活性[1]。鉴于海藻糖对低等生物细胞具有这种特殊的保护作用，人们开始尝试探索海藻糖是否对哺乳动物细胞也有类似的作用，研究发现海藻糖对一些体细胞，如胰岛内分泌细胞[2]和成纤维细胞[3，4]都有不同程度的保护作用。近几年，人们将海藻糖应用于人类血细胞的冷冻保存或冻干保存中。Pellerin-Mendes等[5]在采用不同浓度的海藻糖冷冻保存红细胞的研究中发现，红细胞在1 mol/L海藻糖溶液中深低温保存后细胞回收率达到81%，上清液游离血红蛋白的浓度仅为0.4 g/L，和传统的甘油冷冻法获得的结果无明显差异。Wolkers等[6]已经成功地将海藻糖导入人血小板的胞质内，其机制可能是温度介导的细胞内吞作用。实验结果显示，负载海藻糖的血小板经冻干后，其存活率大约为90%，复水后存活的血小板功能全都恢复，且已用于动物实验。
　　海藻糖的独特性质

　　很多学者在比较了海藻糖与其他一些小分子量糖类之后，发现海藻糖具有其特有的物理和化学性质，而正是这些特有的性质使其具有特有的保护作用。
　　海藻糖的异常水合能力

　　Kawaai等[7]的研究表明，在已研究的二糖中，海藻糖周围的不冻水分子数大，如果以每个葡萄糖单位周围的不冻水分子数计算，海藻糖的不冻水分子是糖类多的。Magazu等[8]比较了海藻糖/水和蔗糖/水在玻璃化相转变附近的振动性质，认为海藻糖/水具有更刚性的结构，也就是说，它能把细胞包封在一种更刚性的结构中，因此海藻糖抗冷冻脱水的能力更强。
　　海藻糖异常的玻璃化转变及晶型转变行为

　　近几年来,玻璃化及玻璃化转变理论逐渐应用于冻干过程的研究。玻璃化是一种避免冰晶形成的低温保护方法，无冰晶固态结构的玻璃态，由于黏度大，流动性差，能阻碍分子扩散和冰晶形成，因而可防止一些化学反应的发生。因此形成玻璃态不仅可以防止冰晶的产生,还可以稳定蛋白质的结构。溶液的玻璃化相变温度(Tg)高可使样本在干燥时及以后的保存中有更高的稳定性[9]。海藻糖的Tg是120℃，比其他双糖体系的相变温度要高得多。任何浓度的海藻糖溶液都比其糖类有更高的玻璃化相变温度，此外高浓度的海藻糖溶液比其他糖类更不容易形成冰晶。Sussich等[10]认为，细菌在失水时获得的休眠状态不仅是因为海藻糖较高的Tg导致的黏度增加，而且与水分失去时的晶型分子排列的变化有关。他们发现了一种无水晶态海藻糖分子。这种晶态的化合物具有独特的可逆性吸收水分，转化成二水化合物，而不改变主要结构特性的作用。这种可逆的过程在海藻糖对生物细胞抗脱水能力的保护上起了非常重要的作用。
　　海藻糖抗高温潮湿的作用
　　Leslie等[11]报道，在有海藻糖存在的条件下冻干后的细菌具有高度的存活率。他们进一步发现，用海藻糖作为冻干保护剂时，将冻干样品(细菌)长时间暴露在潮湿的空气中，细菌仍保持了高度活性。Esteves 等[12]在近的实验中指出，在进行免疫交联物的冻干过程中，海藻糖和其他双糖均表现出不同程度的保护作用。但若将冻干样品保存在相对潮湿的高温条件下，用海藻糖作为冻干保护剂的冻干样品比其他样品更加稳定。这一结果对在较恶劣的条件下保存和运输免疫交联物、疫苗、抗血清等产品的有着重要意义。在理想的干燥和保存条件下，海藻糖也并不是佳的保护剂。相关研究表明，联合应用多聚体和其他小分子量糖类，对细胞也会起到相似的保护作用[13，14]，在某些保存条件下，甚至会起到更好的效果。但在较差的环境中，海藻糖却能够比其他糖类更好地维持细胞的稳定性。所以，海藻糖作为一种细胞保存研究中的保护剂仍然受到密切的关注。海藻糖对细胞的保护机制海藻糖对细胞的保护机制一直是众多研究的热点，目前主要有以下两种观点。
　　水替代学说
　　生物体中的蛋白质、糖、脂肪和其他大分子物质均被一层水膜保护着。在干燥过程中，水分逐渐消失，导致这些大分子物质发生不可逆的变化，如蛋白质分子的空间结构的变化。Crowe等[15]认为，当蛋白质结构水失去时，海藻糖可在失水部位以羟基和分子形成氢键，这使得分子在缺水条件下仍能保持其原有结构，而不丧失活性。脱水过程中，海藻糖一方面能和磷脂形成氢键，抑止膜泡聚合，另一方面在高温下能有效降低膜相变温度，防止再水化时发生吸水破坏。
　　玻璃态学说
　　大多数的研究者都认为海藻糖的玻璃化状态在长时间保存细胞活性中发挥了重要作用。生物细胞的玻璃化状态被认为是细胞脱水过程中膜保护的机制之一，玻璃化既可以发生在室温条件下(干燥)，也可以发生在零度以下(降温冷冻)。在这两种情况下，只要溶液粘滞度升高到～1014Pa/s(溶液浓度增加或温度降低均可造成溶液粘滞度的升高)就会出现溶液的玻璃化态。玻璃化状态何以能保护细胞膜?这是由于：① 玻璃化抑止降温时冰晶的形成，避免了深低温保存时细胞受到的冰晶伤害和由于局部离子浓度过高而造成的化学伤害;② 在胞膜可以发生损害性相变的温度和水合条件下，保护液的玻璃化则可以降低解链温度(Tm)，尽可能地保持胞膜的流动状态。在冻干脂质体的研究中，当有海藻糖的存在时，脂质体的Tm在干燥状态时降低到-20℃，从而使脂质在干燥状态下仍能保持液晶态，再水化过程中也不出现脂质的相位转化。
　　细胞负载海藻糖方法研究
　　在早期的冻干研究中，冷冻之前细胞在含有葡萄糖的缓冲液中进行孵育。除此之外，在细胞外加入一种多聚体(羟乙基淀粉或者葡聚糖)来提高溶液的玻璃化温度(Tg)。这种混合使用低分子量糖和有较高Tg的多聚体在体外干燥保存脂质体取得了很好的效果[16]，但在冻干保存红细胞时，羟乙基淀粉或葡聚糖对细胞的稳定作用会降低，这可能是因为多聚体的体积较大，很困难使其进入细胞内部所致。使用二糖作为冻干保护剂面对的主要问题是如何解决质膜对这些糖类的非渗透性，而使其在胞内达到足够高的浓度来发挥作用。冻干人红细胞的步，应该是实现红细胞对海藻糖的负荷。对一个成功的冻干红细胞的方案，将海藻糖导入细胞质是关键的一步。国外将海藻糖导入哺乳动物细胞的实研究方法如下。① Oliver等[17]和Wolkers等[6，18]利用细胞内吞作用在不同的实验中分别将海藻糖导入人的间质干细胞和血小板。② Beattie等[2]利用胞膜在磷脂相转变过程中的易渗性成功地将海藻糖导入胰岛细胞。作者指出，二甲亚砜可能作为一种弱的表面活性剂在膜的相变过程中大大增加海藻糖的渗透性。③ Eroglu等[19]和Chen等[4]利用转基因的α-溶血素金黄色葡萄糖球菌，一种打孔蛋白，在哺乳动物细胞胞膜上产生跨膜孔形成可逆性的透化处理。通过这种方法，作者发现海藻糖可以改善几种人类细胞系对冷冻和干燥处理的耐受性。④ Guo等[20]和Puhlev等[21]通过基因表达编码人类包皮纤维母细胞的6-磷酸海藻糖合酶和6-磷酸海藻糖磷酸酶，从而增加此种细胞干燥耐受性。同样的，另一种转基因的哺乳动物细胞株，可使胞内海藻糖浓度达到80 mmol/L，也使其渗透脆性得到改善。⑤Katkov等[22]和Shirakashi等[23]在其他的海藻糖负荷研究中，对哺乳动物细胞施行电打孔术。尽管海藻糖可较容易的进入细胞内，但打孔后的细胞常常渗透脆性增加，不适合进一步冻干保存。⑥Satpathy等[24]在近的研究中采用了一种有效的，温和的方法将海藻糖导入人红细胞。这种方法基于红细胞胞膜的热性质并提供红细胞对海藻糖在37℃足够的吸收时间(7小时)。数据表明，通过细胞内外渗透压不平衡和磷脂相变的联合作用可使胞内海藻糖浓度达到50 mmol/L。
　　红细胞负载海藻糖可能的作用机制
　　红细胞对海藻糖的负荷明显依赖于胞外海藻糖溶液的浓度。细胞内外的渗透压不平衡能促进细胞对海藻糖的摄取，随着胞外海藻糖浓度的增加，胞内海藻糖量也增加。红细胞对海藻糖的摄取未发现有饱和依赖性。与之不同的是，人血小板对海藻糖的摄取有浓度依赖性。Wolkers等[18]在实验中发现：37℃孵育，胞外海藻糖浓度在0-35 mmol/L时，血小板对海藻糖的吸收率成直线上升。当胞外海藻糖浓度达到75 mmol/L时，海藻糖的摄取率反而下降，负荷血小板对激动剂的反应能力下降。小分子物质如葡萄糖、赤藻糖醇、乙烯二醇、甘油等可通过易化扩散通过红细胞胞膜，而尿素、硫脲等物质通过被动扩散完成跨膜转运，其浓度梯度作为主要推动力。Satpathy等[24]在实验中发现：当胞外海藻糖浓度低于600 mmol/L时，红细胞对海藻糖没有明显的摄取。这说明其摄取机制可能并不是易化扩散，因为易化扩散可以在很低的胞外介质浓度时发生。但当胞外海藻糖浓度大于600 mmol/L时，红细胞对其的摄取开始增加，似乎又表明海藻糖的跨膜转运能量有部分是来源于细胞内外的渗透压差，增加细胞内外海藻糖的浓度梯度看来是海藻糖跨膜转运中首先出现的推动力。由阿利纽斯作图法(Arrhenius plot)计算所得的转运海藻糖所需的活化能是16.05±1.5 kcal/mol。Weith等[25]报道，赤藻糖醇经易化扩散通过人红细胞胞膜时，需要的活化能为21.5±0.7 kcal/mol。当胞外海藻糖浓度固定(且足够高)时，红细胞在4℃和37℃孵育条件下，胞内海藻糖量是不同的，有理由认为：海藻糖的跨膜转运不单是经易化扩散，而是伴有膜脂的向温性换位。红细胞对海藻糖的摄取明显依赖于孵育温度，而后者能影响红细胞胞膜的流动性。4℃条件下，红细胞对海藻糖的摄取率很低，37℃时，摄取率明显增加，这个结果同温度降低引起红细胞膜磷脂有序性升高的现象是一致的。红细胞膜在14℃时由于膜磷脂的“溶解”，出现相变的低协同效应，另一个协同效应出现在34℃，由富含胆固醇和神经鞘磷脂区域的“溶解”所引起。红细胞对海藻糖大的摄取量(胞内海藻糖浓度大约为55 mmol/L)发生在37℃，此时的红细胞膜磷脂处于液晶态[26]，这个温度略高于使神经鞘磷脂微区解链或“漂移”的温度(34℃)[27]。 Satpathy等[24]推测“漂移”效应可能参与了37℃时红细胞膜对海藻糖的转运，导致了此温度条件下胞膜对海藻糖的较高摄取量。苯甲醇实验进一步证实了海藻糖的转运与红细胞胞膜的物理性质有关。如果海藻糖的跨膜转运由脂质相变所介导，那么细胞膜的液化剂将增加低温下的海藻糖的摄取。苯甲醇是一种膜液化剂，分隔红细胞膜引起胞膜相变温度降低。 Satpathy等[24]在实验中，将红细胞置于800 mmol/L的海藻糖溶液中于4℃孵育22小时，从而使胞内海藻糖浓度明显增加。增加胞膜流动性可提高胞内海藻糖浓度表明，改变细胞膜的物理状态在海藻糖跨膜转运过程中发挥一定的作用。
　　【参考文献】
　　1 Newman YM, Ring SG, Colaco C. The role of trehalose and other carbohydrates in biopreservation. Biotechnol Genet Eng Rev,1993; 11:263-294

　　2 Beattie GM, Crowe JH, Lopez AD, et al. Tehalose: a cryprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long-term storage. Diabetes, 1997; 46: 519-523

　　3Garcia-de-Castro A, Tunnacliffe A. Intracellular trehalose improves osmotolerance but not desiccation tolerance in mammalian cells. FEBS Letters, 2000; 487: 199-202

　　4Chen T, Acker JP, Eroglu A, et al. Beneficial effect of intracellular trehalose on the membrane integrity of dried mammalian cells. Cryobiology, 2001; 43: 168-181

　　5Pellerin-Mendes C, Million L, Marchand-Arvier M, et al. In vitro study of the protective effect of trehalose and dextran during free-zing of human red blood cells in liquid nitrogen. Cryobiology, 1997;35: 173-186

　　6 Wolkers WF, Walker NJ, Tabin F, et al. Human platelets loaded with trehalose survive freeze-drying. Cryobiology, 2001;43: 79-87

　　7 Kawai H, Sakurai M, Inoue Y, et al. Hydration of oligosaccharides: anomaious hydration ability of trehalose. Cryobiology, 1992; 29:599-606

　　8 Magazu S, Branca C, Faraone A, et al. Comparison of disacchaide solution across glass transition. Physica B, 2001; 301:126

　　9 周俊, 刘景汉. 血小板冻干保存的研究进展. 中国实验血液学杂志，2004; 12 : 542-545

　　10 Sussich F, Skopec C, Brady J, et al. Reversible dehydration of trehalose and anhydrobiosis: from solution state to an exotic crytal?. Carbohydrate Research, 2001, 334: 165-176

　　11 Leslie SB, Israeli E, Lighthart B, et al. Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying. Appl Environ Microbiol， 1995; 61： 3592-3597

　　12 Esteves MI, Quintilio W, Sato RA, et al. Stabilisation of immunoconjugates by trehalose. Biotechnol Lett， 2000; 22: 417-420

　　13 Crowe JH, Oliver AE, Hoekstra FA, et al. Stabilization of dry membranes by mixtures of hydroxyethyl starch and glucose: the role of vitrification. Cryobiology, 1997; 35: 20-30

　　14 Hincha DK, Hellwege EM, Meyer AG, et al. Plant fructans stabilize phosphatidylcholine liposomes during freeze-drying. Eur J Biochem， 2000; 267: 535-540

　　15 Crowe JH. Anhydrobiosis: an unsolved problem. American Naturalist, 1971; 105:563-573

　　16 Crowe JH, Oliver AE, Hoekstra FA, et al. Stabilization of dry membranes by mixtures of hydroxyethyl starch and glucose: the role of vitrification. Cryobiology, 1997, 35: 20-30

　　17 Oliver, Jamil K, Crowe JH, et al. Loading MSCs with trehalose by endocytosis. Cell Preservation Technol, 2004; 2: 35-44

　　18 Wolkers WF, Looper SA, Fontanilla RA, et al. Temperature dependence of fluid phase endocytosis coincides with membrane properties of pig platelets. Biochim Biophys Acta, 2003; 1612: 154-163

　　19Eroglu A, Russo MJ, Biaganski R, et al. Intracellular trehalose improves the survival of cryopreserved mammalian cells. Nat Biotechnol, 2000; 18: 163-167

　　20Guo N, Puhlev I, Brown DR, et al. Trehalose ex[x]pression confers desiccation tolerance on human cells, Nat Biotechnol, 2000; 18: 168-171

　　21Puhlev I, Guo N, Brown DR, et al. Desiccation tolerance in human cells, Cryobiology, 2001; 42: 207-217

　　22 Katkov II. Electroporation of cells in application for cryobiology: summary of 20 year experience. Probl Cryobiol, 2002; 2: 3-8

　　23 Shirakashi R, Kostner CM, Muller KJ, et al. Intracellular delivery of trehalose into mammalian cells by electropermeabilization. J Membr Biol, 2002; 189: 45-54

　　24 Satpathy GR, Torok Z, Bali R, et al. Loading red blood cells with trehalose: a step towards biostabilization. Cryobiology, 2004; 49: 123-136

　　25Weith JO. Effects of hexoses and anions on the erythritol permeability of human red cells. J Physiol, 1971; 213: 435-453

　　26 Wolkers WF, Crowe LM, Tsvetkova NM, et al. In situ assessment of erythrocyte membrane properties during cold storage. Mol Membr Biol, 2002; 19: 59-65

　　27 Moore DJ, Sills RH, Patel N, et al. Conformational order of phospholipids incorporated into human erythrocytes: an FTIR study. Biochemistry, 1996; 35: 229-235