替勃龙对去卵巢大鼠脑缺血再灌注保护作用

作者：田文艳,张洪义1,苏立凯,申文增1　　作者单位：1 河北大学 (河北大学附属医院，河北 保定 071000)

　　【摘要】目的研究替勃龙对缺血性脑损害的神经保护作用及可能机制。方法 30只雌性成年SD大鼠，随机分为假手术组，模型组,替勃龙组;采用大鼠大脑中动脉闭塞制成局灶性脑缺血模型。在缺血2 h、再灌注24 h后立即断头取脑,应用TTC染色观察脑梗死体积，TUNEL法检测凋亡细胞数，免疫组化法检测Bcl2以及白介素(IL)1β和肿瘤坏死因子(TNF)α的表达，并进行组织病理学观察。结果 替勃龙组较模型组脑梗死体积显著缩小(P<0.05);TUNEL阳性细胞数少(P<0.01);Bcl2阳性细胞增多(P<0.01);IL1β及TNFα表达减弱，差异有显著性(P<0.01)。结论 替勃龙可减轻去卵巢大鼠脑缺血再灌注损伤，具有神经保护作用。
　　【关键词】 替勃龙;脑缺血;凋亡;IL1β;TNFα
　　【Abstract】 ob[x]jective To study the neuroprotective effect of tibolone and the possible roles during cerebral ischemia injury.Methods 30 healthy adult female Sprague Dawley rats were selected, and randomly divided into shamoperated, ovariectomized, tibolone (2.5 mg·d-1·kg-1) groups.Brain ischemia model was induced by left middle cerebral artery occlusion (MCAO) for 2 hours, at 24 hours after reperfusion.All animals were killed.Cerebral infarction volume was determined by 2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride (TTC) staining and image analysis.Apoptotic cells were labeled by terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling (TUNEL) .The ex[x]pression of Bcl2 /IL1β/TNFα was analyzed by immunohistochemical method.The changes of tissue pathology were also investigated.Results Cerebral infarction volumes were reduced significantly in tibolone treated groups than thos in ovariectomized group (P<0.05).Tibolone decreased the ex[x]pression of TUNEL (P<0.01), and increased the ex[x]pression of bcl2 (P<0.01).The protein ex[x]pression of IL1β and TNFα in tibolone group decreased obviously compared with those in ovariectomized group (P<0.01).Conclusions Tibolone decreases the injury following cerebral ischemiareperfusion in OVX rats and have neuroprotective effect.

　　【Key words】 Tibolone; Cerebrovascular Disorders; Apoptosis; IL1β; TNFα
　　据流行病学调查研究表明，雌激素替代治疗能使绝经期妇女脑梗死的相对危险度及与相关死亡率下降〔1〕。替勃龙(tibolone,7甲基异炔诺酮)为一种组织特异性的甾体类固醇，对骨及阴道组织产生雌激素样作用,但不刺激子宫内膜和乳腺组织，不仅能改善更年期症状,还可能在老年女性心脑血管疾病预防及治疗方面发挥有利作用〔2〕。本文旨在探讨替勃龙对去卵巢大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤保护作用及可能机制，为临床绝经后妇女合理应用雌激素替代治疗提供更多理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验动物

　　5月龄健康雌性SD大鼠30只，体重250～270 g，由河北医科大学实验动物中心提供(动物使用许可证号SCXK20031003)。
　　1.1.1 实验动物分组

　　按体重随机分为3组：假手术组、模型组、替勃龙组，各组10只。假手术组行下腹切开,见到双侧卵巢,但不切除任何组织;其余两组于脑缺血术前14 d切除双侧卵巢。替勃龙组，替勃龙(荷兰欧加农生产,南京欧加农制药分装)0.25 mg·kg-1·d-1灌胃;假手术组和模型组每日同等量蒸馏水灌胃。实验期间所有动物置于同一室内,二级环境分笼饲养,自由饮水,室温(21±4)℃,光照12 h,黑暗12 h。
　　1.1.2 脑缺血再灌注模型制作
　　用改良Longa法制作大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)模型。以10%水合氯醛麻醉后，暴露并钝性游离左侧颈总动脉(CCA),结扎同侧CCA近心端和颈外动脉(ECA)分叉部,距CCA末端约5 mm处剪口,用直径0.24 mm的日本尼龙线沿颈内动脉(ICA)方向插入,深度由分叉部算约 (18.5±0.5)mm,于ICA近心端结扎该动脉,全层缝合切口,再灌注时抽出尼龙线10 mm。以动物清醒后爬行时向右转圈(追尾现象),严重时向右跌倒,提尾时右前肢内收屈曲,为入选标准。于脑缺血手术2 h后再灌注，24 h后断头取脑。
　　1.2 指标检测及方法

　　1.2.1 脑梗死体积测定
　　大鼠脑缺血2 h,再灌注24 h后断头取脑。取左侧大脑半球，冠状面均匀切成2 mm 厚脑片，染色固定，照相测量并计算出总的梗死体积。用计算机多媒体彩色图像分析系统测量脑梗死体积。
　　1.2.2 免疫组化及细胞凋亡的检测
　　大鼠脑缺血2 h,再灌注24 h后断头取脑,距额极3～5 mm冠状切取材,放入4%多聚甲醛固定24 h后,制成石蜡切片,用于免疫组织化学染色。SP法检测抗凋亡基因Bcl2的表达以及白细胞介素1β(IL1β)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的表达。采用多功能真彩色细胞图像分析管理系统(美国Media Cybernetics 公司ImagePro Plus)。在光镜下图像分析,每张切片采集缺血周边区具有代表性10个高倍视野,计算平均数。采用缺口末端标记(TUNEL)法原位标记DNA片段检测凋亡细胞。具体步骤参照产品说明书。
　　1.3 统计学方法
　　应用SPSS10.0 统计软件，数据以x±s表示,多组间比较进行方差分析及两两比较q检验。
　　2 结 果
　　2.1 梗死体积

　　两组梗死体积差异显著(P<0.05)。见表1。表1 替勃龙对脑缺血模型大鼠梗死体积的影响
　　2.2 细胞凋亡

　　模型组对侧仅见数个阳性细胞散在分布,缺血侧可见大量黄棕色阳性细胞,以圆形为主。假手术组凋亡细胞数(10±1)%，替勃龙组(11±1)%，模型组(28±2)%，与模型组比较替勃龙组凋亡细胞数明显减少,差异有显著性(P<0.01)。见图1。图1 各组缺血侧皮层TUNEL染色(×400)

　　2.3 Bcl2在同侧皮层表达的百分率
　　在脑组织切片中,Bcl2阳性表达表现为胞质棕黄色深染。假手术组阳性细胞数(32±2)%，替勃龙组阳性细胞数(33±2)%，模型组阳性细胞数(5±1)%，替勃龙组较模型组Bcl2阳性细胞增多(P<0.01)。
　　2.4 IL1β、TNFα在同侧皮层表达的百分率

　　在脑组织切片中，IL1β及TNFα阳性表达表现为胞质棕黄色深染。替勃龙组较模型组IL1β及TNFα表达减弱(P<0.01),见表2。表2 各组大鼠脑皮层IL1β、TNFα的表达

　　3 讨 论
　　有研究证实外源性雌激素可以明显降低实验性MCAO大鼠的死亡率,减少脑梗死面积,证明外源性雌激素具有缺血性神经保护作用〔3〕，然而外源性雌激素因增加乳腺及妇科肿瘤发病率而限制了临床应用。替勃龙是一种组织选择性雌激素活性调节剂,它对身体的某些特殊部分产生雌激素活性。但是,它在子宫内膜上不起雌激素的作用，不刺激子宫内膜增殖,对乳腺无雌激素效应。本实验通过观察替勃龙替代治疗对去卵巢大鼠局灶性脑缺血再灌注后炎症因子及细胞凋亡指标的变化，发现替勃龙治疗组缺血/再灌注24 h，组织中IL1及TNF表达均较对照组减低，而凋亡拮抗因子Bcl2表达增强，神经细胞凋亡数减少，并且脑梗死体积明显缩小，具有保护神经元的作用。与Chiappetta〔4〕，Won〔3〕等的研究结果一致。
　　脑缺血再灌注损伤是一系列复杂的病理过程，脑缺血后再灌注期间组织发生复杂的继发性改变,加重组织损伤。再灌注后神经元的死亡有坏死和凋亡2种方式,且两者可以并存。炎症反应在脑缺血再灌注损伤中也发挥重要作用。脑缺血再灌注早期产生的IL1β、TNFα等炎性因子可激活白细胞(特别是多形核白细胞和单核巨噬细胞)黏附到脑缺血区微血管内皮细胞上,引起内皮细胞皱缩、破裂和坏死,破坏血脑脊液屏障,并可在细胞因子作用下迁移入脑组织，释放各种细胞毒性物质(如蛋白酶、磷脂酶、NO等)损伤脑组织，参与神经元的损害。正常情况下IL1β与TNFα的表达水平非常低，但在脑缺血发生后可以被诱导，表达迅速增加〔5〕。
　　细胞凋亡即细胞程序性死亡，是脑缺血后神经元死亡的另一种重要形式，是由多个基因参与调控的非炎症性死亡。据报道在MCAD栓塞所致的局灶性脑缺血后,用分子生物学方法增加脑内的Bcl2的表达,可减少神经细胞的凋亡。Bcl2蛋白是一种与细胞器,尤其是线粒体膜相关的稳定蛋白,主要位于线粒体外膜、内质网膜和核膜,它可保护膜的稳定性,减少细胞内、核内Ca2+浓度的改变,从而阻止凋亡信号的传导。目前认为Bcl2基因是一种重要的内源性抗凋亡因子,缺血脑组织中Bcl2的表达是抑制细胞凋亡的关键步骤。综上所述,替勃龙可能通过抗炎及抗凋亡作用发挥其神经元保护作用。
　　【参考文献】
　　1 CasteloBranco C,GarciaFantini M,Haya J.Vascular reactivity and atheromatous plaques in postmenopausal women on tibolone treatment.Open prospective study with Doppler ultrasonography in internal carotid artery〔J〕.Maturitas,2005;50(4):25965.

　　2 田文艳，武红利，钟亚丽，等.利维爱对绝经后妇女氧化低密度脂蛋白及内皮功能的影响〔J〕.中国老年学杂志,2008;28(21)：21112.

　　3 Won CK，Kim MO，Koh PO.Estrogen modulates Bcl2 family proteins in ischemic brain injury〔J〕.J Vet Med Sci,2006;68(3):27780.

　　4 Chiappetta O，Gliozzi M，Siviglia E,et al.Evidence to implicate early modulation of interleukin1beta ex[x]pression in the neuroprotection afforded by 17betaestradiol in male rats undergone transient middle cerebral artery occlusion〔J〕.Int Neurobiol，2007;82:35772.

　　5 Aly H，Khashaba MT，ElAyouty M,et al.IL1beta，IL6 and TNFalpha and outcomes of neonatal hypoxic ischemic encephalopathy〔J〕.Brain Dev，2006;28(3):17882.