结核分枝杆菌Ag85BmRNA在脊柱结核病灶中的检测和临床意义

作者：刘云宏,王自立,司建炜,何玉泽　　作者单位：宁夏医科大，宁夏 银川 ;宁夏医科大附属医院，宁夏 银川

　　【摘要】 目的 探讨逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)在脊柱结核临床诊治中的应用价值，从病原学角度出发探讨脊柱结核手术病灶的切除范围。方法 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测25例脊柱结核患者病灶硬化壁、硬化壁外“亚正常骨”以及干酪样坏死组织中的结核分枝杆菌Ag85BmRNA。结果 干酪样坏死组织、硬化骨组织、亚正常骨组织Ag85BmRNA检测阳性率分别76%(19/25)、64%(16/25)、28%(7/25)，组间差异有统计学意义(P<0.05),平均报告时间2d。结论 (1)逆转录聚合酶链反应检测脊柱结核病灶中结核分枝杆菌，具有快速、灵敏、特异性高等特点;(2)脊柱结核病灶硬化壁中存留具有生物活性的结核菌;(3)亚正常骨组织应根据具体情况并结合影像资料判断切除范围。
　　【关键词】 脊柱结核;结核分枝杆菌;Ag85bmRNA;RT-PCR

　　Detection and clinical significance of mycobacterium tuberculosis Ag85mRNA in the focus of spinal tuberculosisLIU Yun-hong, WANG Zi-li, SI Jian-wei, et al.(Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)

　　[Abstract] ob[x]jective To investigate application value of the reverse transc[x]ription polymerase chain reaction (RT-PCR) in clinical diagnosis and treatment of spinal tuberculosis. And to explore the scope of surgical resection of spinal tuberculosis from the etiological point of view.Methods The RT-PCR was used for detection of mycobacterium tuberculosis Ag85BmRNA in 25 cases with spinal tuberculosis of sclerosis lesions wall, outside wall hardening “sub-normal bone,” as well as the cheese-like necrotic tissue.Results Ag85BmRNA positive detection rates in caseous necrosis tissue, bone tissue sclerosis, sub-normal bone tissue were respectively 76% (19/25), 64% (16/25) and 28% (7/25), and there were group significant difference among the groups (P<0.05).Conclusion Reverse transc[x]ription polymerase chain reaction detection in the focus of spinal tuberculosis in mycobacterium tuberculosis is rapid, sensitive and specific high; There is biologically active tuberculosis in the focus of spinal tuberculosis in the left wall hardening; Sub-normal bone tissue should be ba[x]sed on the specific circumstances of combined image data to determine the scope of resection.

　　[Key words] Spinal tuberculosis; Mycobacterium tuberculosis; Ag85bmRNA; RT-PCR

　　我们应用单管巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测脊柱结核患者病灶中的结核分枝杆菌Ag85BmRNA，分析结核分枝杆菌在脊柱结核病灶不同病变组织中存在情况，从病原学角度出发探讨脊柱结核手术病灶切除范围。
　　1 材料与方法
　　1.1 一般资料：2007年1月-2008年4月宁夏医学院附属医院脊柱骨科住院、确诊并手术的脊柱结核患者中，根据Jain等[1]的椎体结核破坏CT分型为硬化型的病例25例。所有患者入院后均经过2周的正规化疗。男16例，女9例;年龄15-53岁，平均38.4岁。其中胸椎结核5例，胸腰段结核9例，腰椎结核8例，腰骶椎结核3例。同期收治的脊柱外伤和脊柱退行性变需手术患者10例，经胸部X-ray检查、追问病史等排除既往有结核病史。10例中男6例，女4例;年龄26-62岁，平均37.3岁;胸椎疾患4例，腰椎疾患6例。
　　1.2 方法：每例脊柱结核患者临床样本分为干酪样坏死组织、硬化骨组织、亚正常骨组织和自体髂骨四部分，连同非结核患者的骨与椎旁软组织样本分别检测Ag85BmRNA，观察阳性表达率。所用主要试剂和试剂盒购自北京泽平科技有限责任公司(美国Promega公司)，引物序列由上海申友生物技术公司合成。使用TRIzol法和氯仿乙醇沉淀法提取所有标本总RNA，按照试剂盒的操作说明进行逆转录和PCR扩增。产物经凝胶电泳进行结果判定。
　　1.3 统计方法：采用SPSS11.5统计软件包进行统计分析。各检测组分组后分别采用χ2检验，以P<0.05为有统计学意义。
　　2 结果

　　2.1 脊柱结核病灶不同组织MTBAg85B基因的检测结果：见表1。
　　表1 25例脊柱结核病灶不同组织MTBAg85BmRNA的检测结果(略)

　　注 ： (1)、(2)、(3)相比，χ2 =15.109，P<0.05; (2)、(4)、(5)相比，χ2=30.461 P<0.05 ;(3)、(4)、(5)相比，χ2=9.076 P<0.05

　　干酪样坏死组织、结核病灶硬化骨的检测阳性率分别为76%、64%，明显高于亚正常骨的检测阳性率28%(P<0.05);病灶周缘亚正常骨的检测阳性率28%，高于自体髂骨对照的4%(P<0.05)。
　　3 讨论

　　Ag85B(antigen 85 complex B)是结核分枝杆菌的特异性分泌蛋白[2]，是在液体培养基和巨噬细胞系统中丰富表达的蛋白之一，与结核分枝杆菌的细胞壁合成有关，分子量30KD，其编码基因fbpB(fibronectin-binding protein B 纤连结合蛋白B)为978bp。可与细胞表面纤连蛋白(fibronectin,FN)结合，是MTB的FN受体，在分支杆菌黏附细胞的过程中起重要作用，提示其与MTB的致病性有关。mRNA是基因转录的产物，指导蛋白质的生物合成。原核生物的mRNA半衰期仅有几分钟，因此一般认为mRNA是一活性增殖细胞的很好的分子标记物。国外文献有mRNA的RT-PCR方法作为结核分枝杆菌活菌检测的成功报道[3]。国内有学者用mRNA的RT-PCR方法作为结核分枝杆菌活菌检测及药敏检测的成功报道[4]。本实验25例脊柱结核病患者病灶中硬化区骨组织MTB 85B基因的检测阳性率64%，亚正常骨MTB 85B基因的检测阳性率28%(7/25)，干酪样坏死组织MTB 85B基因的检测阳性率76%(19/25)，统计学检验差异有统计学意义。结果表明，经正规化疗后，脊柱结核病灶不同组织中仍然具有生物活性的结核分枝杆菌存留。此方法较结核菌培养法[5]更加快捷，灵敏，特异性高。
　　林羽[6]将临床上椎体硬化性改变大致分为活动性病变的硬化和静止稳定性病变的硬化。活动性病变的硬化为不稳定硬化,应手术切除，而静止稳定性病变的硬化通常硬化可维系数年或一、二十年之久, 无需特殊治疗或手术治疗。Kim[7]发现临床上认为已经骨性修复愈合的骨病灶，在活检时骨骼中尚存在典型的结核病变长达十年之久。病理研究提示[8]，距离主病灶平均数值为4mm(95%可信区间)处的硬化壁区内有微小结核病灶(卫星灶);药代动力学研究提示[9]，化疗药物难以进入硬化区内从而无法形成有效的药物浓度，这也可能是脊柱结核术后复发和产生耐药结核菌株的一个原因。金大地等[10]认为, 只需部分切除硬化骨, 能够满足摘除死骨、植骨床准备以及抗结核药物的渗透。本实验25例脊柱结核病患者病灶中硬化区骨组织MTB 85B基因的检测阳性率64%，亚正常骨MTB 85B基因的检测阳性率28%(7/25)，进一步提示硬化骨和邻近硬化骨的亚正常骨应该作为结核性病变看待。脊柱结核前路手术切除硬化骨壁可达到更为的病灶清除，打破阻滞药物进入的屏障，使化疗药物能够进入病灶处并达到有效杀菌浓度，达到消灭残存的结核菌的目的。对于邻近硬化区的亚正常骨，在不影响术后脊柱稳定性的前提下尽可能切除，以免遗留隐匿病灶。
　　【参考文献】
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