链霉菌JXJ402产生的抗生素JXJ4021的研究

　作者：张炳火,张玉琴,李汉全,杨兆勇,方亮,高　　作者单位：九江学院生命科学院， 九江

　　【摘要】在筛选微生物来源抗生素的过程中，从500余株链霉菌中发现十余株抗真菌阳性菌株，其中JXJ402菌株显示出较强的抗稻瘟病菌活性。从该菌株固体发酵粗提取物中分离纯化到化合物JXJ4021。经13CNMR数据分析，确定其化学结构与文献报道的尼日利亚菌素(nigericin)结构一致。生物学活性研究发现，化合物JXJ4021具有抗稻瘟病菌、赤星病菌、白念珠菌、藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌等真菌和细菌活性，其中抗稻瘟病菌和赤星病菌活性未见文献报道。
　　【关键词】 瘟病菌 链霉菌 尼日利亚菌素 活性实验
　　Studies on antibiotic JXJ4021 produced by Streptomyces JXJ402

　　Zhang Binghuo1, Zhang Yuqin2, Li Hanquan1, Yang Zhaoyong2,

　　Fang Liang1, Gao Lingyu2 and Wen Mengliang3

　　(1 College of Life Sciences, Jiujiang University, Jiujiang 332000;

　　2 Institute of Medicinal Biotechnology, Peking Union Medical College and

　　Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050;

　　3 Institute of Microbiology, Yunnan University, Kunming 650091)

　　ABSTRACT During the course of screening for antifungal antibiotics, about ten positive strains were found from 500 Streptomyces. Among them, strain JXJ402 showed strong inhibitory activity against Pyricularia oryzae. Compound JXJ4021 was isolated from the solid medium of strain JXJ402 by silica gel and Sephadex LH20. Via analysis of spectral evidences and 13CNMR data of JXJ4021 and nigericin, JXJ4021 was identified as nigericin. Bioassay showed compound JXJ4021 has inhibitory activities against fungi and bacteria, such as Pyricularia oryzae, Alternaria alternate, Candida albicans, Micrococcus luteus and Bacillus subtilis. Inhibitory activities of nigericin against plant pathogenic strains Pyricularia oryzae and Alternaria alternate were firstly reported.

　　KEY WORDS Pyricularia oryza; Streptomyces; Nigericin; Bioassay

　　稻瘟病是水稻三大病害之一，在流行年份，重灾地区一般减产10%～20%，严重的达40%～50%。20世纪90年代以来，我国稻瘟病年发生面积均在380万公顷以上，年损失稻谷达数亿公斤[1]。三环唑[5甲基1，2，4三唑并(3，4b)苯并噻唑]是目前防治稻瘟病的主要药剂，至今没有较好的替代药剂，因此，一旦产生耐药性，后果无法估量。近年来，中国部分稻区出现了三环唑防效下降的现象，怀疑是由耐药性所导致[2]。因此，筛选和研制抗(杀)稻瘟病菌的新型农药日益受到人们重视。
　　在从链霉菌中筛选微生物来源的抗生素研究过程中，发现了十余株具有抗真菌活性的阳性菌株。通过对稻瘟病菌有较强活性的阳性菌株JXJ402的研究，从中分离和纯化出化合物JXJ4021(结构见Fig.1)。本文主要报道该化合物的发酵、提取、结构鉴定和生物学活性研究。Fig.1 Structure of compound JXJ4021

　　1 仪器与材料
　　质谱用VG Auto Spec3000型质谱仪测定;核磁共振用Bruker AVDRX500测定;红外用AVATAR360FIR测定;旋光仪Jasco(日本生产);元素分析用德国Vario EL有机元素分析仪测定;柱层析用凝胶Sephadex LH20(安玛西亚生物技术有限公司);柱层析及薄层层析用硅胶为青岛海洋化工厂生产;所用试剂均为重蒸工业试剂;菌株是从江西庐山土壤样品中分离并获得纯培养的链霉菌。
　　2 方法与结果
　　2.1 发酵

　　JXJ402菌株的发酵采用二级发酵。首先将培养好的JXJ402菌株斜面(培养基成分：酵母膏4g，葡萄糖4g，麦芽膏5g，复合维生素3.5mg，微量盐1ml，琼脂20g，定容至1000ml，pH7.2。微量盐组成：FeSO4•7H2O 0.2g， MnCl2•4H2O 0.1g，ZnSO4•7H2O 0.1g，蒸溜水100ml)，接种于种子培养基(去掉斜面培养基中的琼脂即可)，置于28℃，180r/min摇床培养48h，再接种于固体发酵培养基(大米26.5g，米糠13.5g，大豆粉10.0g，水50ml，pH7.5，121℃湿热灭菌1h，冷却前震松散)，在28℃温室静置培养8d。
　　2.2 分离和纯化
　　发酵至终点后，固体发酵物用工业丙酮∶乙酸乙酯(1∶1，V/V)混合液浸泡，并超声破碎30min，在4℃冰库放置24h，再抽滤，滤渣弃去，滤液减压蒸去有机溶剂，剩余部分加入2倍体积的工业乙酸乙酯，连续萃取3次，萃取相减压浓缩至浆状物，浆状物以少量甲醇和丙酮溶解，与200～300目硅胶混合均匀，完全干燥后上硅胶柱，用氯仿∶甲醇(1∶0→20∶1→15∶1→10∶1→5∶1→0∶1，V/V)进行分级梯度洗脱，得若干组分，合并目的组分并蒸干，再加少量甲醇溶解上凝胶柱Sephadex LH20，洗脱液为甲醇，合并较纯部分，蒸干后上硅胶柱，石油醚∶丙酮(4∶1，V/V)洗脱，后获得目的活性化合物JXJ4021。整个过程用TLC分析，显色剂为Anis显色剂(甲醇85%，乙酸10%，硫酸5%，另加大茴香醛1%)。
　　2.3 生物学活性分析
　　10ml甲醇溶解2mg JXJ4021样品，以直径为0.5cm的滤纸片蘸取样品溶液，置于接种有指示菌的培养皿中，28℃培养箱中恒温培养。指示菌分别为灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、镰刀菌(Fusarium graminearum)、赤星菌(Alternaria alternata)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和白念珠菌(Candida albicans)等。对照组采用直径为0.5cm的滤纸片蘸取纯甲醇溶液。培养基为前述的斜面培养基。
　　2.4 化合物JXJ4021的结构解析
　　化合物JXJ4021为无色粉末，[α]22D=+46.7°(CHCl3，6.26mg/ml)，易溶于氯仿和乙酸乙酯，无紫外吸收，Anis显色剂显色，先呈黄色，1～2d后变成红色。
　　JXJ4021的质谱ESI(+)MS m/z：747[M+Na]+，元素分析数据为C：66.64%，H：10.07%，O：23.29%，质谱和元素分析表明该化合物分子式为C40H68O11，分子中有7个不饱和度。IR(KBr)cm-1：3445(OH)，2938(CH3)，2875(CH2)，1725(C=O)。13CNMR(CDCl3)数据见Tab.1，13CNMR以及DEPT谱中出现15个CH，10个CH2，10个CH3，5个季碳信号，13CNMR化学位移与尼日利亚菌素(nigericin)基本一致[3]。结合二维核磁共振相关谱，终将该化合物确定为尼日利亚菌素。
　　3 生物活性
　　活性实验结果表明，JXJ4021对稻瘟病菌有较强抑制活性，抑菌圈直径达4.65cm，对赤星病菌和白念珠菌两种真菌也有一定抑制活性，抑菌圈直径分别为2.42和2.25cm;另外，JXJ4021对枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌也有较好抑制活性，抑菌圈直径分别为4.41和3.75cm;对本实验中的其它指示菌没有抑制活性。
　　4 结论和讨论
　　菌株JXJ402代谢产物对稻瘟病菌有较强的抑制作用，通过对其固体发酵产物的研究，从中纯化出主要活性产物JXJ4021。根据元素分析、红外、质谱和核磁共振谱的分析，终确定该化合物为文献报道的尼日利亚菌素。
　　尼日利亚菌素是钾离子的专一性离子载体抗生素，可促进钾离子和氢离子的交换，增加线粒体膜对钾离子和氢离子的通透性，抑制氧化磷