肿瘤转移蛋白Ezrin在恶性肿瘤中的作用研究进展

　作者：孙鹏，成方静，梁尚争

　　【关键词】 恶性肿瘤 Ezrin蛋白

　　目前世界转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因，大约90%的恶性肿瘤患者死于肿瘤转移[1]。从Stephen Paget提出肿瘤转移的种子土壤学说至今，对于肿瘤转移机制的研究已有一百多年历史，随着肿瘤转移基因调控下的多阶段、多因素、多步骤理论的不断完善，人们对于肿瘤转移这一极为复杂的病理过程有了更进一步的认识，发现并证实与肿瘤转移过程高度相关的基因，现已成为肿瘤转移机制研究领域的热点，因为这些基因不但使我们可以更深入地了解肿瘤转移的机理，更重要的是，其基因产物有可能成为抗肿瘤转移的靶点或观察肿瘤患者预后、转移的指标。许多科学家对Ezrin蛋白的编码基因及其在恶性肿瘤中的表达做了大量的研究，虽然取得了大量的成绩，但也存在一些不足，现综述如下。
　　1 Ezrin蛋白的基因定位
　　Ezrin的编码基因是villin2，定位于染色体6q25.2q26，属于ERM家族成员，该家族包括：Ezrin、Redixin、Moesin、Merlin4种结构相近的蛋白，分别在细胞的多种活动中发挥作用。Ezrin是1981年由Bretscher在鸡的小肠上皮细胞刷状缘中被纯化的，而ERM家族另外3个成员Radixin、Moesin和Merlin，则分别在1988、1989和1993年被发现。
　　2 Ezrin蛋白的结构、功能
　　Ezrin(又称：埃兹蛋白)作为ERM家族中个被发现的成员，其结构和功能被研究得相对为透彻。Ezrin蛋白在N末端有一个同源性很高的FERM功能域(FERM domain)，在C末端的氨基酸位置上有一个关键的、与其激活有关的苏氨酸磷酸化位点[7]。FERM功能域在介导细胞表面黏附分子(如CD44、Ecadherin、ICAM2)与细胞骨架通过ERM家族蛋白连接的生理功能中起着关键作用。Ezrin蛋白以两种形式存在：一种是非活性状态;另一种是活性状态，由关键的C末端苏氨酸残基经Rho或PKC等途径磷酸化激活，再经膜上PIP2的招募作用，导致其在特定细胞区域的聚集，而暴露的C末端尾部具有肌动蛋白细胞骨架结合位点(Factin binding site)，通过Ezrin的桥接作用，可将肌动蛋白细胞微丝与细胞膜相连，从而产生一系列细胞功能，如细胞形态的改变、细胞运动、黏附、有丝分裂、细胞极性等。可以这样说：Ezrin就是将细胞膜蛋白(如CD44、ICAM2)与肌动蛋白细胞骨架连接起来的桥接蛋白，这种连接不但是结构上的，而且还是功能上的。通过介导膜与细胞骨架的连接，Ezrin在细胞的运动、迁移、有丝分裂等生理功能中发挥重要作用。
　　3 Ezrin与肿瘤转移
　　Akisawa等[2]检测了16种胰腺癌细胞株，其中的两种Scco9和Szvpl0表现出高转移性，Ezrin mRNA和蛋白有较高水平的表达，而其他亚系只是低表达。结果表明，胰腺癌的转移能力与Ezrin的高表达有相关性。Wan等[3]在K7M2诱导形成的鼠骨肉瘤模型中发现，通过转染反义Ezrin或SiRNA阻断Ezrin的表达或转染氨基末端显性负相的Ezrin破坏其功能都能显著的减少鼠的肺转移。李琼等[4]在乳腺癌淋巴结转移中也发现，Ezrin在乳腺浸润性导管癌中的表达明显高于良性病变，且有淋巴结转移者比无转移者更明显，说明Ezrin在乳腺癌中对肿瘤发生淋巴结转移有重要促进作用，可以作为预测浸润性乳腺导管癌淋巴结转移的肿瘤标志物。Kobel等[5]用免疫组化的方法研究164例FIGO分期I期的子宫内膜癌患者，认为可以作为FIGO分期I期的子官内膜癌预后指标。以上研究表明，Ezrin表达增高可以促进肿瘤转移，与肿瘤预后不良密切相关。但近来的报道也值得思考：Valdman等[6]发现，Ezrin在大多数前列腺癌中高表达是预后不良的因素，在一些良性化生上皮及精囊腺也有高表达，可能与Ezrin在肿瘤转移中的作用具有细胞特异性有关。
　　4 Ezrin在肿瘤转移中的机制
　　Ezrin是否在肿瘤转移过程中发挥主要作用，目前尚不十分清楚，但Ezrin在许多肿瘤组织中都高表达，参与多种不同组织来源恶性肿瘤转移的事实，已通过大量实验得以证实[7]。
　　4.1 Ezrin与细胞表面受体分子的相互作用 大量实验证实：细胞表面分子(CD44、Met等)与肿瘤转移之间的关系密切，而Ezrin与这些膜受体蛋白分子均具有复杂的相互作用。Ezrin的过表达不仅影响肿瘤转移的某个环节，而是可能参与到肿瘤转移的多个环节，包括从原发灶脱落、侵入周边组织、侵入脉管系统、穿过基底膜、选择性的在靶器官增殖形成转移灶等，这说明Ezrin有可能作为肿瘤转移各环节、各通路的中心调控因素发挥作用。Ezrin可以直接与细胞基质透明质酸的受体CD44分子的胞浆部分发生作用，而CD44已被证实在很多肿瘤的转移中发挥作用，它可以介导肿瘤细胞迁移、侵袭，并且是跨细胞信号转导的重要环节[8]。实验表明：CD44分子过表达可引起膜细胞骨架连接蛋白Ezrin的功能激活，从而可导致骨肉瘤细胞系转移能力的增强。
　　Ezrin还被证实与Met基因的产物肝细胞生长因子的受体有关。MET是肝细胞生长因子受体，能够调节肿瘤的侵袭和转移，HGFMETCD44形成的络合物是MET激活的前提条件，CIM4V6的胞质尾区聚集Ezrin是信号从MET转移给MEK和细胞外信号调节激酶ERK所必需的。Ezrin与MET/HGF、CD44相互作用形成复合物发挥MET促进肿瘤侵袭转移的作用，缺乏CD44的胞质尾区或Ezrin的螯合阻断HGF诱导的信号转移。而Met基因早已被证实与包括骨肉瘤在内的多种肿瘤的进展有关。研究表明，刺激CD44受体同样也可以导致Met基因产物的上调及激活[9]。近OrianRousseau等[10]的实验显示，CD44、Ezrin、Met等有可能通过Ezrin与CD44结合的功能域相互作用，并通过MEK/ERK信号传导途径，诱导瘤细胞侵袭表型的发生。
　　4.2 Ezrin与细胞黏附功能 正常组织细胞、肿瘤细胞及基质三者之间的黏附连接对肿瘤的生长侵袭及远处转移非常重要，Ezrin作为这一环节的中心体，除了整合诱导细胞向侵袭表型转化的信号转导之外，还在影响细胞黏附方面同样扮演着重要角色。Ezrin蛋白的一个功能即是参与形成细胞表面复合物，从而介导细胞细胞、细胞基质的黏附，而E钙黏素、整合素，则是这种细胞表面复合物的重要组分。E钙黏素在正常情况下能够对CD44的活性起负调控作用，它可以抑制CD44介导的肿瘤细胞侵袭作用及形成细胞表面突起的能力[11]。E钙黏素的丢失以及功能的下调，都可能促进肿瘤的侵袭转移。Yu等[7]在实验中通过RNA干扰的方法，有效抑制了横纹肌肉瘤细胞中Ezrin的表达，与对照组相比，细胞表面的突起形成受到明显抑制，血管生成亦减少。这说明Ezrin的过表达，有可能导致E钙黏素功能的缺失，从而引起E钙黏素与CD44功能的失衡。近的研究证实了上述假设：激活状态的Ezrin，的确可以通过在胞内蓄积E钙黏素的方式破坏其功能，从而导致细胞细胞间接触的破坏[8]。整合素是近年来肿瘤转移研究领域的一个热点，它作为细胞与周围基质相互作用的桥梁，一直被认为和肿瘤转移高度相关。然而，整合素对于肿瘤侵袭转移究竟是促进亦或是抑制，至今仍存有争议，但普遍推测，整合素与细胞的定着非依赖性细胞生存有关。因此，Ezrin及其他ERM家族蛋白有可能通过破坏整合素信号转导的机制，使肿瘤细胞在循环系统及转移位点微环境中的生存能力显著增强。Khanna等[12]在实验中从反面证实了上述假设：通过反义RNA的方法，有效抑制了Ezrin在高转移活性的骨肉瘤细胞中的表达，并进而构建了小鼠的骨肉瘤肺转移模型，通过比较抑制组与高表达组骨肉瘤细胞在肺转移灶中的生存时间长短，发现Ezrin表达被抑制后，转移的骨肉瘤细胞生存能力明显下降。也就是说，Ezrin的确与转移肿瘤细胞的生存能力有关。
　　Ezrin表达增强，致使肿瘤细胞运动能力增强，同时Ecadherin遭破坏，在细胞与细胞之间的表达能力下降，导致肿瘤细胞自肿瘤组织中脱落，引起肿瘤的转移。Ezrin发挥作用主要通过胞内Ecadhefin累积的方式，激活状态的Ezrin使Ecadhefin在细胞内聚集而细胞表面Ecadhefin减少，使得依赖后者形成的连接破坏，Ezrin也可使细胞聚集减少而分离增加，细胞间隙增宽，伪足形成，运动力增强，侵袭力增强，在骨肉瘤和横纹肌肉瘤中Ezrin过表达有类似BRMS1基因缺失的作用，阻断细胞间的黏附连接[13]。
　　4.3 Ezrin与细胞细胞间的通讯连接 众所周知，肿瘤细胞与周围基质细胞之间的相互作用对于肿瘤组织本身的生长、侵袭非常重要，作为细胞细胞间通讯连接的组织蛋白，Ezrin有可能成为肿瘤细胞与周围基质细胞之间的相互作用的桥梁。Ezrin能将细胞与细胞在结构及功能上连接起来，细胞的外部与内部的功能的连接需要有信号途径传导信息，重要的途径之一是由Rho介导的[14]。Ezrin的FERM 区与Rho因子负调节因子Rho因子GDP分解抑制蛋白(RhoGDP dissociation inhibitor，RhoGDI)结合，Rho的负调节解除，Rho因子参与许多与肿瘤转移相关的细胞表面分子与胞内信号转导的过程，促进肿瘤的转移已被大量事实证明。Rho的活性状态RhoC的过度激活增加黑色素瘤的转移而其非活性状态则抑制转移。Croft等[15]报道，RhoA、RhoC、RockI(Rho的效应蛋白I)、RockII的提高促进上皮细胞的形成和新血管的形成，使得肿瘤生长，减少肿瘤细胞的聚集，促进肿瘤细胞的运动和扩散，所以抑制Rock的功能减少肿瘤转移和血管发生是一种有效的化疗策略。近来有实验报道[16]，PI3K/AKT和cSrc单独及合作效应在Ezrin的促迁徙及转移中起重要作用;另外，Ezrin与Na+/H+交换调节因子也逐渐成为实验研究的热点。Sarrio等在研究乳腺癌时发现，免疫组化染色显示，Ezrin在正常乳腺上皮定位于顶面，而在大多数乳腺肿瘤则定位于胞质和胞浆，且胞质染色阳性的表现出恶性肿瘤的特征，如ki67的高表达、雌激素受体的缺失、有淋巴结的转移，顶面染色阳性与有利的临床病理特征和非淋巴结转移有关。总的来说，Ezrin从顶膜至胞质胞浆的易位与乳腺癌的去分化和不良的特征有关。
　　另一方面，正常细胞细胞间通讯的破坏，对于肿瘤转移同样也很重要。Brmsl基因是近发现的一个肿瘤转移相关基因，它的产物可以抑制肿瘤转移[17]。Brmsl基因的缺失以及伴随的细胞间间隙连接的缺失，可以导致乳腺癌细胞转移能力的增强[9]。Ezrin在骨肉瘤和横纹肌肉瘤中的过表达，可能有类似于Brmsl基因缺失的作用，因为Ezrin的过表达，有可能通过细胞细胞间通讯连接的胞内蛋白的部分隔离，导致细胞细胞间通讯连接的破坏，从而使肿瘤转移能力增强。
　　4.4 Ezrin与信号转导机制 Ezrin蛋白是与肿瘤转移高度相关的细胞表面蛋白(CD44、Met、Ecadherin等)和细胞内部其他分子之间的连接蛋白，这种连接不但体现在结构上，更重要的还体现在功能上。也就是说Ezrin介导了细胞信号转导过程。ERM蛋白的活性由磷酸化以及与磷脂结合共同调节，而具体激活途径是由Rho介导的。有趣的是，ERM蛋白同样可以以正反馈环的方式正调控Rho的功能。ERM蛋白可以和Rho因子GDP解离抑制蛋白(Rho GDP dissociation inhibitor，RhoGDI)相结合，而后者是作为Rho的负调控因子发挥作用的。因此，ERM蛋白和RhoGDI的结合导致失活状态的Rho因子释放，进而允许GDP转化成GTP，从而激活Rho。Ezrin及ERM家族蛋白的过表达，必然会导致更多的RhoGDI与之相结合，从而使相应的Rho信号转导产生放大效应。Rho信号转导途径对于肿瘤转移的重要性至少已在两种肿瘤中得到证实：Clark等[18]证实对于黑色素瘤，RhoC的过表达可以促进肿瘤的转移能力，而抑制Rho的表达则可明显抑制肿瘤转移;Gildea等[19]则在胆囊癌中发现，RhoGDI2基因产物的缺失与胆囊癌的转移高度相关。Yu等[7]的研究发现，Rho的活性与Ezrin呈正相关，抑制了RhoA的表达后，高转移横纹肌肉瘤细胞的转移能力大大降低。而且，近年来的研究结果显示，许多与肿瘤转移相关的细胞表面分子的胞内信号转导过程都有Rho因子的参与。以上事实均从不同角度证实了由Rho因子介导的细胞表面分子信号转导途径的失调对于肿瘤转移的重要性。Ezrin的过表达有可能通过对信号转导的负性调控因子的限制作用，导致正常细胞信号转导网络的失衡，从而使象CD44或Met这样的可以产生肿瘤转移效应的细胞表面分子所传递的信息被放大，终导致肿瘤的转移。
　　4.5 Ezrin与肿瘤吞噬能力 早在100多年前研究就发现肿瘤细胞具有吞噬死细胞、细胞碎片及基质成分能力，具有象巨噬细胞那样的吞噬能力。利用不同的定量手段对各种不同肿瘤的高低转移能力的细胞系进行了研究比较，结果发现高转移细胞系的吞噬能力明显高于低转移细胞系，认为恶性肿瘤细胞的吞噬能力与它的转移能力呈正相关。Lugini等[20]发现，具有高度转移能力的人类黑色素瘤具有很强的吞噬能力，这种吞噬能力甚至与巨噬细胞相当，更为重要的是，在黑色素瘤细胞和一些人类腺癌的吞噬小泡表面，Ezrin呈现密集表达状态;特异性抑制Ezrin表达后，瘤细胞吞噬能力消失。这些研究结果提示，Ezrin的表达与恶性肿瘤的吞噬能力相关。但以往的实验研究显示，Ezrin的表达水平并非完全与恶性肿瘤的转移、预后平行[21]。这可能是由于某些涉及到Ezrin的磷酸化激活机制的失调，终导致了Ezrin蛋白功能的增强，从而使肿瘤吞噬及转移能力增强。Rho因子GTP磷酸酶(RhoGTPase)在肿瘤转移过程中处于过表达状态，而RhoGTPase是激活Ezrin的重要因子。因此，在肿瘤转移过程中，Ezrin不一定表达增加，但其功能会增强，这也就解释了在一些研究中Ezrin的水平与肿瘤的转移、预后并不平行的现象[21]。
　　4.6 Ezrin上游调控的初步研究 尽管Khanna等[12]和Yu等[7]的研究明确显示Ezrin的过表达对于骨肉瘤和横纹肌肉瘤转移非常关键，但是对于Ezrin表达的上游调节我们仍然知之甚少。而只有真正弄清其上游表达调控，才有可能终控制肿瘤转移。这些调控途径上的相关分子，都可以成为抑制肿瘤转移治疗的靶点蛋白。Six1基因是Yu等[7]在研究中发现的与横纹肌肉瘤转移高度相关的另一个基因，Sixl基因参与骨骼肌的发育。Yu等[22]发现Sixl基因和Ezrin的表达与肿瘤转移能力相关类似，其表达水平与横纹肌肉瘤的转移能力高度相关：在低转移能力的细胞中，通过增强Sixl基因的表达，可以显著增强细胞的转移能力;而在用RNA干扰的方法降低Sixl基因的表达后，具有高转移能力的细胞株的转移能力则大大下降[7]。有趣的是，Sixl基因的表达恰恰与Ezrin的表达平行，提示Ezrin有可能受Six1基因的调控。
　　总之，不管Ezrin是否真的是包括骨肉瘤、横纹肌肉瘤在内的多种不同组织来源的肿瘤转移的核心分子，Ezrin与肿瘤转移的密切相关性已为越来越多的研究者所认同。对Ezrin功能的了解不是学者们的终目的，真正弄清其上游表达调控，才有可能终控制肿瘤的转移，这些与调控有关的分子都会成为治疗肿瘤转移的关键。探究Ezrin过表达促进肿瘤转移机制方面的实验研究正在展开。目前可以肯定的是，Ezrin在促进肿瘤转移方面，存在着复杂的多种作用机制。Ezrin除了与细胞表面受体分子、细胞黏附功能、信号传导机制及肿瘤吞噬能力等有关外，而且与肿瘤细胞逃避fas介导的细胞凋亡、通过结合P糖蛋白增强肿瘤细胞多药耐药性等均有密切关系，Ezrin极有可能是通过多种途径增强肿瘤侵袭、转移能力的。目前从临床应用角度的研究已初步揭示了Ezrin表达水平与骨肉瘤患者预后之间的关系。今后通过在不同肿瘤中深入研究Ezrin表达水平与患者预后的关系，Ezrin有可能成为多种肿瘤预后或者转移的分子标志物。同时，通过对其上游调控因子的进一步深入研究，将有助于我们揭开肿瘤转移之谜，找到治疗肿瘤转移的有效生物靶点，从而有效的治疗肿瘤转移。
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