骨髓间充质干细胞治疗肺动脉高压的研究进展

肺动脉高压(pulmonary artery hypertension, PAH)是一组以肺血管阻力持续增加为主要特征的临床综合征,其病因和发病机制未明,临床治疗困难,预后较差。近年来随着分子生物学及细胞生物学的发展,特别是干细胞的研究,给PAH的治疗带来了新的曙光。本文现就骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)治疗PAH的进展进行综述。

1 BMsCs的生物学特性
早在1867年,德国科学家Cohnheim发现骨髓中除了造血干细胞以外还有一些非造血干细胞。此后Friedenstein进一步描述了这些呈纺锤状贴壁生长的细胞,并发现在一定条件下能分化形成类似骨及软骨的沉积物,这种细胞就是BMSCs[1]。骨髓中间充质干细胞占有核细胞总数的0.001%~ 0.010%,并随年龄的增长而减少,分析间充质干细胞的细胞周期发现,20%为G0期细胞,大多数细胞处于G0/G1期,表明间充质干细胞具有高度的分化潜能。

BMSCs既有间质细胞的表面抗原特征,又有内皮细胞、上皮细胞、肌细胞的表面抗原,但不表达造血细胞表面抗原标志(CD14,CD34,CD45),也不表达与人白细胞抗原相关的因子(B7-1,B7-2,人白细胞抗原DR等),缺少特异的表面标志分子。 BMSCs表达的主要分子包括:① 黏附分子,如 CD166、CD54、CD1o2、CD44、CD106等。② 生长因子和细胞因子受体,如白介素受体(IL-1R、IL-3R、 IL-4R、IL-6R、IL-7R),y干扰素受体(IFN-yR)、肿瘤坏死因子α(TNR-α)等。③整合素家族成员,包括CD49、CD29、CD104等。④ 其他,如CD90、 CD105等[2]。根据这些单克隆抗原阳性特征,可以对骨髓单个核细胞进行分离纯化,得到纯度较高的 BMSCs。

2 BMsCs的多向分化潜能

BMSCs在一定条件下可定向分化为骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、骨髓基质及星形细胞, 另外还可以向外胚层内胚层的细胞分化。Khoo等采用以生长因子刺激为基础的三阶段神经元分化程序 (使 用 FGF-2/EGF/PDGF/SHH/FGF-8/ GDNF)刺激BMSCs,发现所形成的神经元细胞在形态及基因表达等方面是不成熟的,能够形成神经球样结构,并高表达NES及NR4A2[3]。Xing等采用聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)作为支架,分离培养大鼠BMSCs,并用5胞苷及0,1umol/L血管紧张素 Ⅱ刺激24h后完全培养基培养,形成心肌样细胞, 表达心肌细胞的标志物抗原肌钙蛋白I[4]。Li等将大鼠BMSCs接种于3D PLGA支架,培养3周后发现细胞表达较高水平的肝细胞标志物如白蛋白、甲胎蛋白、角蛋白18、肝细胞核因子α及细胞色素P450[5]。干细胞之所以具有多向分化潜能,与其复杂的调控网络有关。细胞因子、黏附分子、转录因子等因素参与,包括多潜能性转录因子Oct4、Nanog和Sox2等,组成复杂的调控网络来调节与干细胞多潜能性和自我更新相关的分子的表达[6]。如IL- 17能够刺激BMSCs表达瘦素[7]。TGF-β1能够刺激BMSCs向成骨细胞及成软骨细胞分化,而抑制其向脂肪细胞分化[3]。另外,表观遗传修饰,如组蛋白和DNA甲基化等,可以协同转录调节因子来共同维持胚胎干细胞状态基因的表达。
3 BMsCs治疗PAH的机制

3.1 纠正内皮细胞障碍 血管内皮是一种抗血栓形成的半透膜,能够维持正常血管张力、止血、生长、分化、趋化及创伤修复等。内皮细胞异常及功能障碍对于PAH的形成具有重要作用[9]。研究表明PAH时内皮细胞受到损伤,凋亡细胞数量增加,同时,由于启动损伤修复机制,血管平滑肌细胞异常增生,形成PAH的特有损伤——丛状损伤,血管腔狭窄甚至闭塞,血流动力学发生改变。BMSCs移植后在局部微环境的作用下,特别是血管内皮生长因子 (VEGF)及流体剪应力等机械刺激的协同作用下向内皮细胞分化[10],整合到血管内皮,从而纠正内皮细胞数量异常及功能障碍,这可能是治疗PAH的主要机制。然而也有不同声音,Sahara等采用未分离的骨髓细胞移植治疗MCT大鼠加左肺切除的 PAH模型时。虽然见到到达内皮层的细胞是中层的十倍,但还是相当少的细胞整合到内皮层,原因可能是种子细胞的来源不同[11],即抑制的是未分离的骨髓细胞。而Rochefort采用同位素示踪技术发现 BMSCs移植后并没有定位于肺血管壁,而大部分定位于骨髓[12],这提示可能还存在其他机制。

3.2 纠正血管舒缩物质比例 内皮细胞功能障碍的主要表现就是舒血管物质如No、前列环素与缩血管物质血栓素A2、内皮素和五羟色胺等的比例失衡,调节血管舒缩物质的比例是治疗PAH的靶点。前列环素I2(PGI2)是膜磷脂释放的花生四烯酸的代谢产物,主要由血管内皮细胞产生。PGI2是重要的血管内皮舒张因子,还具有抑制血管中层平滑肌细胞增殖及血小板聚集作用。PG12可以促使内皮细胞释放NO,而No也能促使PGI2生成增加。 PAH时前列环素合酶(PCS)表达降低,PGI2生成减少。Takemiya等研究发现,给野百合碱诱导的 PAH大鼠模型静脉注射携带有PCS基因的 BMSCs后,采用同位素示踪技术发现BMSCs主要聚集在肺脏,而且治疗组肺脏的前列环素水平增高且维持较长时间,治疗组存活期超过7周, 而对照组仅为38%和44%,能够明显改善PAH的预后[13]。

3.3 纠正钾离子通道的异常,抑制平滑肌细胞增生钾离子通道是一种高度选择性的蛋白通道,共有 4种类型:钙活化型钾离子通道、内向性整流型钾离子通道、串联孔域型钾离子通道及电压依赖型钾离子通道(voltage dependent K+ challnel,Kv)。其中 Kv是目前研究多的一种。Kv对于维持膜电位以及调节细胞内游离钙离子浓度具有重要意义,抑制 Kv会导致细胞膜电位升高而去极化,激活电压门控钙离子通道,使钙离子进人细胞内而导致血管收缩、平滑肌细胞增殖,并且抑制其凋亡[14-15]。特发性 PAH患者与继发性PAH患者相比,其肺动脉平滑肌细胞Kv明显受到抑制,从而细胞钙离子内流增多,使肺动脉收缩加强,平滑肌细胞增殖1161。在减肥药右旋酚氟拉明诱发的PAH中,发现不仅仅是平滑肌细胞,巨核细胞也同样存在Kv缺陷,这种缺陷导致血小板释放五羟色胺增多,再摄取减少,从而引起血管张力的增高[17]。缺氧可抑制肺阻力血管平滑肌细胞的Kv,导致钙离子通道开放增加,从而引起缺氧性肺血管收缩及平滑肌细胞增殖,改善Kv 功能能够抑制PAH的发展[18]。研究表明利用腺病毒转染的survivin磷酸化缺陷基因能够增加钾离子通道的表达,抑制PAH的形成[19],而采用载有 survivin磷酸化缺陷基因的BMSCs则可能会通过增加钾离子通道的表达而起作用。也有研究表明, 转载有肾上腺髓质素基因的内皮祖细胞 (endothelium progenitorcells,EPCs)移植较单独移植EPCs更有效的抑制野百合碱诱导的PAH[20]。

3.4 抑制炎症反应 目前认为多种细胞因子参与的炎症机制是PAH发生的重要原因。缺氧、自身抗体、病原微生物等多种因素可以导致促炎因子表达升高,激活炎症细胞和下游的信号转导通路,启动平滑肌细胞及成纤维细胞的增殖过程和炎性病变, 进而引起微血管管腔变狭与闭塞,形成PAH。干细胞移植可以抑制促炎因子的释放,抑制炎症反应,调节血管对血管活性物质的反应性[21],从而抑制 PAH的形成。
3.5 补充内源性EPCs 循环中EPCs是一小群来源于骨髓的干细胞,能够随着血液循环到达血管内皮,对于修复损伤的内皮细胞具有重要意义。大量研究表明PAH时EPCs明显减少,而去除循环中 EPCs时则可能会发生肺间质纤维化和PAHE2[22-24]。移植BMSCs后可能会增加循环中的EPCs,从而达到抑制PAH的形成。这已经在体外实验中得到证实。Zhao等取骨髓来源的单个核细胞,采用内皮培养基培养7~10d后呈现典型的内皮细胞样改变, 包括细胞呈铺路石样排列,并表达内皮细胞标记物, 如Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白,荆豆凝集素,血管假性血友病因子和胎儿肝激酶1(Flk-1),表达率高达65%~83%[25]。Raida等采用重组人骨形成蛋白2(rhBMP-2)刺激BMSCs后发现VEGF及胎盘生长因子表达明显增加,用培养BMSCs的细胞培养液上清刺激EPCs则能引起EPCs明显增殖, 单用rhBMR2刺激EPCs则不能引起其增殖,但可引起其趋化性增强。这提示BMR2可能通过刺激 BMSCs分泌一些生长因子来诱导EPS增殖及趋化的。

3.6 促使新生血管形成 肺微循环血管闭塞、血管床减少是PAH的重要原因之一。BSMCs移植后可能通过产生血管生长因子等来刺激新生血管形成,从而改善肺微循环,达到降低肺动脉压的目的。新生血管的形成是一种复杂的过程,是多种分子与细胞相互作用的结果,不仅包括内皮细胞、循环中的内皮祖细胞,还包括VEGF、BMP2、ICAM等, BSMCs移植可以修复内皮细胞损伤,并通过分泌细胞因子及生长因子等引起血管新生,Sanz等[26]的研究表明了这一点。Duffy等发现,在血管形成的早期,BMSCs能够刺激内皮细胞的增殖、迁移,降低内皮细胞的通透性,且这种作用呈现时间-剂量依赖关系。提示BMSCs在新生血管形成、稳定与成熟方面发挥着重要的作用[27]。

4 BMSCs治疗PAH的临床应用
我国浙江医科大学附属医院的Wang 等[28]选择特发性PAH患者31例,诊断依据临床评估、右心导管、超声心动图、螺旋CT、肺血管造影、及肺通气灌注扫描、肺功能测试,心功能NYHA2-3级,平均肺动脉压力大于30mmHg、6分钟步行距离测试大于等于50m。每例患者抽取250ml外周血,通过Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,培养在纤连接蛋白包被的培养皿中,采用含20%人血清及血管内皮生长因子50ng/ml的M199培养基进行培养。5d后90%的细胞显示DiI-acLDL阳性。31例患者随机分为治疗组与对照组,治疗组在传统治疗的基础上以(1.1± 0.6)× 107个细胞制成 10ml细胞悬液静脉注人,共16例;对照组15例进行传统治疗。随访12周,治疗组组6分钟步行距离平均增加48.2m,而对照组增加5.7m,两组之间差别显著。治疗组平均肺动脉压、肺血管阻力和心输出量明显改善,且未发生严重事件。该研究显示静脉注射自体EPCs细胞是可行的、安全的,并且具有增加IPAH患者运动能力和改善肺动脉血流动力学的益处。此后,Patel等[29]报道了2例,其中一例是44岁高加索人,慢阻肺合并PAH患者,接受干细胞移植后在数天内症状改善明显,然而随后数月内逐渐恶化,尽管症状逐渐恶化,他的6分钟步行距离及心脏彩超检查结果均保持较移植前改善状态,2 年后准各接受再次移植。另一例是78岁老年高加索男性,慢阻肺合并PAH患者,接受干细胞移植后症状并无明显改善,但移植3个月后彩超检查右心舒张末压41mmHg,较基础55mm Hg明显减低, 随访一年无明显变化。这与Zhao等报道的结果明显不同,由于临床报道较少,具体原因有待于继续观察。⒊eward等报道8例婴儿恶性骨硬化症患者同种异体干细胞移植后并发重度PAHE3。彐,GⅡ gg等也报道1例36岁女性移植物抗宿主反应患者发生 PAH[31],这也为干细胞移植的安全性提出了挑战。

5 问题与展望
尽管近年来对BMSCs的研究取得了很大进展,但仍然存在以下问题尚待解决:① 目前很多结果均来自动物实验,临床数据较少且结果不一,为进一步临床应用,需进行较长时间安全性评估及疗效观察;②干细胞的定向分化受其所处微环境的影响,在体外实验中可以有效控制,但在体内,特别是病理条件,由于疾病的病因未去除,干细胞移植后能否持续发挥疗效值得研究;③基因治疗与干细胞移植相结合显示出较单纯干细胞移植更大的优势,必将成为研究热点。
参考文献

[1] 王福科,刘流,李俊男,等,间充质干细胞在组织工程中的应用进展中国组织工程研究与临床,2O10,14:6800-6804.

[2] 郭峰,张翠改,许彦芝,BMSCs的研究进展 疑难病杂志, 2O10,9:393-394∶