宫内膜细胞p16基因表达检测筛查子宫内膜癌的研究

        子宫内膜癌是妇科肿瘤中常见的恶性肿瘤之一，占女性生殖道恶性肿瘤的200-/0 - 300-/0，近年来，发病率有逐年上升的趋势阻1。分段诊断性刮宫（以下简称诊刮）是目前在术前诊断子宫内膜癌的主要方法，其结果是决定子宫内膜癌手术重要的依据，直接决定了手术治疗方案及手术范围。但是，分段诊刮操作复杂、风险较高、疼痛较强，高危妇女（晚绝经、长期激素替代、服用三苯氧胺等）对其依从性较差。 研究表明使用子宫内膜毛刷采集子宫内膜细胞进行官腔细胞学检查，对于子宫内膜癌的筛查具有较好的应用价值‘纠。本研究采用子宫内膜毛刷采集子宫内膜细胞，采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real - time Quantitative Reverse Transc[x]riptionPolymerase Chain Reaction，RT - PCR)检测子宫内膜细胞p16基因表达来筛查子宫内膜病变，并与诊刮的方法进行比较。探讨应用子宫内膜细胞p16基因表达检测的方法，筛查子宫内膜癌的可行性及临床应用价值。

        1.材料与方法

        1.1研究对象
        自2012年3月至2013年9月，因不规则阴道出血、绝经后出血、子宫内膜增厚等原因于皖南医学院第二附属医院祁南京市妇幼保健院就诊的患者51例。年龄28 -72岁，平均(47.5±9.5)岁。

        1.2.研究方法
        1.2.1 取材方法 应用子宫内膜细胞采集器采集官腔细胞，取样后加入RNA保存液，- 80℃保存待测。后进行全面诊刮，刮出物立即固定送检，行病理学检查。

        1.2.2病史及记录详细记录患者官腔位置及深 度、采集器使用情况、出血量、主观感觉等；同时记录实施诊刮时患者上述情况及指标。

        1.2.3 诊断标准诊刮组织病理子宫内膜癌病理 类型按照WHO/ISCP的分类标准，分为良性病变、子宫内膜癌。

        1.2.4出血量的测算标准 目测法与使用量杯法。

        1.2.5疼痛诊断标准①无明显疼痛：仅有轻微不适感，无疼痛主诉；②轻微疼痛：有轻微腹部疼痛感，能够配合手术；③较重疼痛：有腹部明显疼痛感，持续时间长，患者痛苦不安。

        1.2.5子宫内膜细胞总RNA的提取及鉴定使用RNeasy Mini Kit试剂盒，按照操作说明书提RNA。紫外分光光度计测定提取总RNA浓度，A260/A280比值在1.8-2.0，1%琼脂糖凝胶电泳显示28S、18S和5S条带清晰，-80℃保存备用。

        1.2.6 互补DNA( cDNA)昀合成 取500 ng总RNA在25 pdL反应体系中逆转录成cDNA，该反应体系组成如下：10×RT缓冲液5VL，oligo dT(18)l VL, dNTP 3lxL, RNAse Inhibitor lVL,M- MLV逆转录酶l斗L，加入DEPC处理水至25 VL。70℃预变性5 min，42℃孵育60 min，- 200C保存备用。

        1.2.7 PCR反应 PCR反应体系为20 yL，包括cDNA 2yL, SYBR green Premix Ex TaqⅡ10 p4L，上、下游引物(10 p4mol/L)各0.8斗L，ROX ReferenceDyeⅡ0.4 111。p16基因上游引物为5’一TIATITGAGCTTTGGITCTC一3 7，下游引物为5 7一CCCGCTITCGTAGr ffITCAT一3 7，产物长度355 bp；ACTB基因__幽钙f物为5’一ATCATGITrGAGACCITCAA -
3 7，下游引物为5’- CATCTCITGCTCGAAGTCCA -3'，产物长度319bp。反应条件：预变性95℃30s，95qC15s．60。C 35s，35个循环。融解曲线分析为95℃15s，600C Imin，95℃15s。p16墓因表达水平采用相对定量方式表示。 13统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，运用Mann - Whitney检验、ROC曲线分析及相关分析方法，P<0.05为差异有统计学意义。

        2.结果
        2.1子宫内膜细胞p16基因表达
        51例患者子宫内膜细胞均检测到ACTB基因mRNA。16例良性病变子宫内膜细胞标本p16基因mRNA水平显著高于35例子宫内膜癌细胞标本(P<0.05)，详见表l。 

        在51例患者中，分段诊刮获取的子宫内膜的组织病理学确诊为子宫内膜癌共35例，见图1。ROC统计发现官腔细胞p16基因检测的诊断敏感性为73. 7%，特异性为78. go-/o( AUC=0.799，95%CI：0. 653 -0.907)，见图2。

        3.讨论
        通过诊刮术获取子宫内膜细胞进行病理学检查是诊断子宫内膜癌的金标准。但是分段诊刮术痛苦较大，出血较多，有一定风险性等特点使得很多患者不愿意进行诊刮或者重复性诊刮术，显然无法用于健康人群的子宫内膜癌筛查。子宫内膜脱落细胞的获取是通过子宫内膜采集器，不需扩张宫颈，受检者不需要承受诊刮、官腔镜检、活检的明显疼痛，出血少，简便安全，较适于内膜癌的筛查。 p16基因编码的P16蛋白足细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的抑制蛋白，具有重要的细胞周期调节功能，通常p16蛋白能与细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)或细胞周期蛋白依赖激酶6( CDK6)特异性结合，从而使细胞周期停滞在Gi -S期，细胞增殖受到抑制，呈现抑癌作用。相反，当p16基因不能正常表达时，将导致细胞异常增殖。

        本研究使用了子宫内膜细胞采集器采集子宫内膜细胞，并且采用RT - PCR方法对p16基因的表达进行检测。结果显示，16例良性病变子宫内膜细胞标本p16基因表达水平显著高于35例子宫内膜癌细胞标本(1. 29 vs 0.46．P=0.027)，提示p16基因异常表达是子宫内膜癌的发病机制之一。子宫内膜细胞p16基因检测诊断子宫内膜癌的敏感性为73. 7%，特异性为78. 9%。 由于子宫内膜细胞采集器获取的通常是官腔脱落细胞，对于官腔较大、官底部、宫角部或早期的子宫内膜癌可能会造成漏诊呻1，因此子宫内膜细胞p16基因表达检测仅可作为子宫内膜癌的筛查，而不能作为确诊方式。
        综上所述，应用子宫内膜细胞采集器采集子宫内膜细胞，进行p16基因表达检测检查，筛查子宫内膜癌是完全可行的，并且具有简单方便，出血量少，无痛等优趑性。适用于门诊及大规模子宫内膜癌的普查，尤其适用于症状人群及高危人群的常规筛查。