2号染色体散发性结直肠癌相关抑癌基因筛选

          在以往的研究中我们发现散发性结直肠癌2q22-24.1区域存在高频杂合缺失现象，提示有抑癌基因存在的可能川。我们采用基因芯片方法对该高频杂合缺失区域的基因进行表达谱研究，筛选表达水平发生改变的基因，结果发现该区域内ACVRlC基因表达显著下调，通过生物信息学分析及实时定量聚合酶链反应(Real-timePCR)，推测该基因可能是结直肠癌候选抑癌基因。 　　
          材料与方法 　　
          1一般资料:收集上海交通大学附属人民医院肿瘤样本库中结直肠癌患者，共19例，其中男10例，女9例，年龄为33一85岁。依据Amsterdam标准将遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)排除在外。所有病例均经病理证实，术前术后均未进行放化疗Duke'sA期3例，B期8例，C期6例，D期2例。近端结肠癌10例，远端结肠癌1例，直肠癌8例。高分化腺癌2例，中分化10例，低分化腺癌2例，黍占液腺癌5例。所有患者均知情同意。 　　
          2.RNA的提取:选择19对结直肠癌组织以及对应正常组织用Trizol(美国Invitrogen公司)一步法提取RN:a，通过异丙醇沉淀法浓缩RNA，并采用NlucleoSpin RNAclean-up试剂盒(德国Macherev-Nagel公司)对P}NA进行纯化，用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检。 　　
          3.DNA芯片制备:在全基因组杂合缺失精细定位研究的工作基础上，通过检索，挑选了678个基因进行散发性结直肠癌候选基因的筛选，其中在2号染色体高频杂合缺失区域选择17个基因(表1)，针对这部分基因设计并合成了寡核营酸探针、另外加人卜Actin(ACTB)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等基因作为内源阳性对照(内标)，并加人酵母基因间序列作为C片实验得外标。所有探针以40N.,mol/[的浓度溶十DNA点样液中，用SmartArra列”芯片点样仪(中国博奥生物公司)点制。 　　          4.样品标记和杂交:样品标记、杂交和扫描过程如下:取5},g总RNA，以含有T7启动子序列的T7Oligo(dT)为引物(T7-Oligo(dT)引物序列:5'-AAACGACGG-CCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGCT7"I"I`T-'I0l0l`l"1t1”1TT`I'T-3'，使用逆转录酶合成单链cDNA。随后，用RNaseH对杂合链中的RNA切成短片段，加人到DNA聚合酶以RNA短片段为引物延伸，合成第2链cDNAo2N,gcRNA在随机引物引发下进行逆转录和Cy5/Cy3标记·2-31。标记的DNA溶于30浏杂交液中[3xSSC,0.2%十二烷基硫酸钠(SDS),5xDerrhart's,25%}酞胺〕,42℃杂交过夜杂交结束后，先在420C含0.2%SDS,2xSSC的液体中洗5min，而后在0.2xSSC中室温洗5min。玻片甩于后即可用于扫描。 　　
          5.数据提取和筛选:芯片用LuxScanlOK/A双通道激光扫描仪(博奥生物公司，中国)进行扫描。每对样品均进行了荧光交换杂交〕采用LuxScan3.0图像分析软件(博奥生物公司，中国)进行数据提取。对芯片上的数据采用Lowess方法进行归一化。采用SAM3.02的一单类(OneClass)方式筛选差异表达基因，控制FDR(q值=0)，并且癌组织与对应正常勃膜组织中基因表达倍数变化值(ratio),2.0或(0.5，则认为该基因为差异表达基因，为便于统计分析，根据上述标准，将所分析的基因水平细分为下调(rati。值>0.5一,1),差异下调(ratio值,0.5)、上调(rati。值>1一<2)和差异上调(ratio值,2)某一差异表达基因在19例病例中出现频率超过9例以_L判定为与表达差异显著基因。 　　
          6.Real-timePCR验证:为验证基因芯片数据，在上述用于芯片研究的19对结直肠癌以及对应正常组织中选取编号为单数的10对样本组织进行Real-timePCR实验取2.5},g总RNA逆转录1st-cDNA。总RNA2.5N,g,OligeodT2N.,1(1}.,g),DEPCH}0加至11}r,l,65℃5min，冰浴5tnin后，加人5x1st缓冲液4},1,0.1mol/LDTT2},1、dN1,Pset1N.,1(2.5mmol/L)、RNasin抑制剂1闪(40U/},l),SSII1.5闪(200U/闪)，420C1h，加人5}.,11.5mol/LNaOH终止，70℃10min,加1闪10N乙酸中和，加灭菌水至50闪。取1闪逆转录产物作为逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)模板，ACVR1C引物序列为AGACGGT.ATCAGAAACAGCAAA(上游引物),ACAGAAAGTAGAATGAAG-GCAAAA下游引物5'}3')(理论产物长度为105bp)，以(3-actin为内参，引物序列:TGT,acGTT-GCTATCCAGGC(上游引物5'}3'),C'I'CCTTAATGT-CACGCACGAT(下游引物5'}3')(理论产物长度为250by)。反应体系:'Template1}1,3mmol/LMgC121.6},l、引物0.8p1(10mol/L),HSS2N1、加ddH20至20p,1,;PCR程序:950C10min,950C15s60℃5x72℃15s,76℃Ss检测荧光，共40个循环，75一950C做融解曲线。Real-timePCR扩增使用LightCvclerPCR仪(瑞士Roche公司)完成7.统计学方法:各变量之间比较采用Fishe:精确厂检验，应用S;4S6.
       

          统计软件分析结果
          1.芯片筛选结果:我们采用基因J邑片技术对17个候选基因的表达水平进行分析对表达数据用SAl软件进行统计学分析，控制FDR(q值)-0，并且基因表达倍数变化值汁atio),2.0或毛0.5，则认为该基因为差异表达基因，某一差异表达基因在19例病例中出现频率超过9例以上判定为与表达差异有统士十学意义基因。在此标准下发现.aC}'R1C为显著表达下调基ICI，相应ratio值分l}!J为0.05,0.07,0.36,0.46,0.57、0.53,0.20、0.35、0.61、0.53、0.03、0.78、0.16、0.79、0.41,4.9},0.16,0.61,NA(未提供有效数据)_该基因的mRNA分别在17例肿瘤组织中表达下调，其中10例下调比例超过2倍。通过统计学分析，发现ACVRIC的表达情况与肿瘤部位、病理类型、临床分期等临床病理特征无明显相关(P>0.05，表2)。 　　
          2.Real-timePCR结果:为验证基因芯片数据，在上述用于芯片研究的19对结直肠癌以及对应正常组织中选取编号为单数的10对样本组织进行Real-timePCR实验，对芯片结果进行验证，结果发现10例的肿瘤组织中ACVR1C均呈现表达下调，rati。值分别为0.04,0.12、0.31、0.52、0.31、0.46、0.03、0.46、0.15、0.99，结果显示Real-timePCR结果与基因芯片结果吻1l习O讨论抑癌基因发生杂合缺失是肿瘤发生的关键步骤之一，对肿瘤DN.A样本进行杂合缺失分析可以发现未知的肿瘤抑癌基因。本课题组以往研究结果显示结直肠癌在2号染色体存在较高的杂合缺失率，推测有抑癌基因的存在[}，我们在以往研究的基础上，采用基因芯片对高频九釜缺失区域进行候选基因筛查，结果可见aCVR1C基因在17例癌组织中表达下调，其中IO例下调比例超过2倍〕ACVR1C一也称为激活素受体类似激酶7(ALK7)，位于2q24.1，在人脑、胰腺、结肠中表达丰富，属于转化生长因子书(TGF-因超家族，是一种TGF-}I型受体TGF书I型受体也称为ALK，是TGF-(3信号通路的核心分子，对细胞增生、凋亡、迁移、侵袭等有调节作用。目前研究结果显示ALKl,ALI}2,ALK3,ALI}4,ALMS与多种肿瘤有关，ACVRIC是新发现的TGF-(3I型受体，研究认为该基因可能通过线粒体通路诱导细胞发生凋亡，与嗜铬细胞瘤、肝癌、卵巢癌等肿瘤发生发展有关}-tol。I}im等iH〕研究表明转染ACVR1C(ALK7)基因可以诱导肝癌细胞发生细胞形态的改变，同时通过梯度电泳和流式细胞技术，提示ALI}7可诱导细胞发生凋亡Xu等}s-io〕也对ALK7诱导卵巢癌细胞发生凋亡的相关通路进行了研究，结果表明转染AI,K7可诱导前凋亡因子B淋巴细胞/白血病一2(bcl-2)相关X蛋白(}>ax)的表达，半胧氨酞天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3被激活，抑制抗凋亡因子。 　　
          参考文献 　　
          Peng Z,Zhang F,Zhou C. Genome-wide search for loss of heterozygosity in Chinese patients with sporadic colorectal cancer[J].INTERNATIONAL JOURNAL OF GASTROINTESTINAL CANCER,2003.39-48.
　　Patterson TA,Lobenhofer EK,Fulmer-Smentek SB. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control(MAQC)project[J].Nature Biotechnology,2006.1140-1150.
　　Guo Y,Guo H,Zhang L. Genomic analysis of anti-hepatitis B virus(HBV)activity by small interfering RNA and lamivudine in stable HBV-producing cells[J].Journal of Virology,2005.14392-14403.
　　周崇治,裘国强,樊军卫. 散发性结直肠癌1号染色体等位基因杂合缺失精细定位研究[J].中华实验外科杂志,2007,(5):560-562.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2007.05.016.
　　唐华美,周崇治,裘国强,等 [5]唐华美,周崇治,裘国强. 散发性结直肠癌1号染色体lq31.1-32.1区域等位基因杂合缺失精细定位研究[J].中华实验外科杂志,2009,(2):148-150.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2009.02.004.
　　Bondestam J,Huotari MA,Morén A. cDNA cloning,ex[x]pression studies and chromosome mapping of human type I serine/threonine kinase receptor ALK7 (ACVR1C)[J].Cytogenetics and Cell Genetics,2001.157-162.
　　J(o)rnvall H,Blokzijl A,ten Dijke P. The orphan receptor serine/threonine kinase ALK7 signals arrest of proliferation and morphological differentiation in a neuronal cell line[J].Journal of Biological Chemistry,2001.5140-5146.
　　Kim BC,van Gelder H,Kim TA. Activin receptor-like kinase-7 induces apoptosis through activation of MAPKs in a Smad3-dependent mechanism in hepatoma cells[J].Journal of Biological Chemistry,2004.28458-28465.