肝癌细胞株HepG2中侧群细胞的生物学特性

　　我们从人肝癌细胞株HepG2中分离出侧群(SP)细胞,并观察其生物学特性,为寻找肝癌干细胞并证明其与转移归巢的关系提供实验依据.
　　材料和方法 　　
　　1.材料:人肝癌细胞株HepG2购于复旦大学肝癌研究所),Hoeclzst33342、维拉帕米、碘化丙锭(PI,Sigma公司)、低豁附6孔板、人工基底膜基质凝胶(Matrigel,美国BD公司)、MultiskanFC酶标仪、流式细胞仪一BDFACSAriaTMII细胞分选系统.
　　2.细胞培养:HepG2用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,放人37℃恒温、5%COZ孵化箱中培养.
　　3.分选SP细胞:重悬细胞于预热的DMEM培养基中,浓度为1x109/L,加人Hoechst至终质量浓度为5m留L,370C,90min孵育,对照组在Hoechst染色前加人终质量浓度为50m扩L的维拉帕米.孵育结束后重悬细胞于冰的Hanks平衡盐,同时加人2m剔LPI以区分坏死细胞,后FAGS分析.下面所有实验都以经流式细胞仪分选出的SP细胞为实验组,对照组选取同代未经分选的HepG2细胞.
　　4.非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SLID)鼠接种实验:雄性NOD/SCID鼠(5周)每组各5只.经分选所得SP细胞调整浓度至2x10'/L.对照组HepG2细胞调整浓度至2x106/L.分别将前述细胞悬液0.2ml注射于小鼠皮下,观察成瘤情况.90d后处死小鼠,取皮下形成的肿瘤,比较其成瘤情况.
　　5.细胞外基质载附实验:分别将100闪SP细胞和对照组细胞悬液接种于包被牛血清白蛋白(BSA),Matrigel的96孔板中,37℃培养1h,按嘎哇蓝(MTT)比色法测定各孔细胞的吸光度(A)值,以对照基底膜BMA组贴壁细胞A值为参照,按公式计算Matrigel组细胞茹附率,每组平行6个样本.
　　6.Tranawell侵袭实验:Transwell上室加人200p,1细抱悬液,下室加人500闪条件培养基.37℃,24h舌显微镜下观察.计数侵袭细胞数,取5(上、下、左、右、中)个视野(x200),记录每个视野的细胞数,计算均值;每组细胞设定6个平行实验组;7.迁移实验:方法类似上述侵袭实验,但Transwell上室未加人Matrigel人工基底膜.
　　8.成球培养:配制添加表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),B27,LIF,LG和肝素的DMEMF12培养基〔’〕,用配制好的无血清培养基重悬,加人低茹附的6孔板中,海孔加人1000个细胞,实验组对照组各6孔,Sd后计数成细胞球个数9.统计学方法:应用SPSS10.0统计软件分析,组间均数比较采用两独立样本t检验.
　　结果
　　1.人肝癌细胞株HepG2存在SP细胞:经细胞核燃料Hoechst33342染色后,用BDFACSAriaT"tII流式细胞仪进行SP细胞检测,检测组可以看到2群细胞,位于左下角的侧群细胞呈鸟嘴状,经流式细胞仪测得约占0.9%.对照组加人不同剂量的维拉帕米后,这群细胞消失.
　　2.NOD/SLID接种成瘤实验:SP细胞接种成瘤实验显示2x104个SP细胞即可成瘤,而对照组接种2x10"个都未能形成肿瘤.移植瘤切取行常规病理切片检查证实为肝细胞癌.
　　3.细胞外基质茹附实验:SP细胞的勃附率为(16.19士3.68)%,对照组细胞豁附率为(25.O1士13.97)%,经两独立样本t检验两者差异无统计学意义(t=1.36,P>0.OS).
　　

　　4.Transwell侵袭实验:SP细胞穿出数为(2014)个,对照组细胞穿出数为(16土3)个,两组差异无统计学意义(t=1.462,P>0.OS,图lA,1B).
　　5.迁移实验:24h后SP细胞穿出的细胞数为(8}士to)个,对照组穿出的细胞数为(4}18)个,差异有统计学意义(t=8.646,P<0.05,图1C,1D).
　　6.成球培养:利用无血清培养基培养,Sd后观察,细胞可形成连接紧密的细胞球,每个球由25一50个细胞组成.镜下计数两组细胞成球的数量,实验组SP细胞形成细胞球的数量为(5419)个,对照组细胞形成细胞球的数量为(1813)个,两组差异有统计学意义(t=8.632,P<0.OS).
　　讨论
　　SP细胞是一群具有干细胞特征的细胞,研究表明包括胃癌、肝癌等消化道恶性肿瘤中存在SP细胞iz=},并且分选出的SP细胞高表达干细胞标志物.
　　本研究结果显示,利用人肝癌细胞株HepG2经流式分选可以得到SP细胞,但比例较低(约1%),这与肿瘤干细胞理论相符,加人维拉帕米后这群细胞消失,证实这群细胞是SP细胞.随后在接种NOD/SLID鼠成瘤_实验中可见SP细胞比对照组细胞有更强的成瘤能力,进一步研究结果显示利用含肝素无血清悬浮成球培养法培养的SP细胞在相同时间内可以形成更多的细胞球,提示在分选出的SP细胞中富集了大量肝癌干细胞,并且干细胞可能在肿瘤形成过程中起关键作用.
　　侵袭实验结果显示SP细胞在体外侵袭能力与对照组细胞比较差异无统计学意义,可能的解释是肝癌微环境还存在各种细胞因子(如趋化因子)和细胞表面分子,新研究还提示肿瘤干细胞在侵袭转移过程中与上皮间质转化(EMT-)现象关系密切.而分选出的SP细胞具有更强的迁移能力,提示SP细胞中所富集的肝癌干细胞具有较强的运动能力.
　　总之,本实验检测并分选出肝癌细胞株HepG2中的SP细胞具有肿瘤干细胞特性,表明HepG2中的SP细胞可能富集了肝癌干细胞.
　　参考文献 　　
　　赵璇,冉宇靓,遇珑. 人肝癌组织中肿瘤干细胞样细胞的分离培养及鉴定[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2009,(5):436-441.doi:10.3872/j.issn.1007-385X.2009.05.003.
　　张毅,宋文杰,李韧. MHCC97中肝癌干细胞的分离及其特性[J].中华实验外科杂志,2008,(1):48-50.doi:10.3321/j.issn:1001-9030.2008.01.016.
　　汪学非,孙益红,李葛. 胃癌侧群细胞分选及生物学特性的体外签定[J].中华实验外科杂志,2009,(1):11-13.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2009.01.004.
　　黄涛,宫东伟,搞全立. 肝癌SMMC-7721细胞中侧群细胞干细胞标记的表达[J].中华实验外科杂志,2011,(1):65-67.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2011.01.024.
　　Mani SA,Guo W,Liao M J. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells[J].Cell,2008,