硫化氢诱发疼痛大鼠脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基的表达变化

         硫化氢(HZ幻是继一氧化氮和一氧化氮(CO)之后体内第3种气体分子它可作用于不同的离子通道和受体,参与调节多种生理功能,并在痛觉信息传递中发挥着重要作用.一3一N一甲基_D一天冬氨酸(NMDA)2B亚基(NR2B)作为NMD受体的重要功能业基,参与伤害性信息传递和中枢敏化的形成一4,而H,S诱发的疼痛与脊髓背角NR2B表达变化的关系目前尚不清楚.我们采用足底注射Naffs以诱发大鼠持续性疼痛,通过给予NMDA受体拮抗剂氯胺酮,观察氯胺酮对H,S诱发疼痛大鼠脊髓背角VR2B亚基表达变化的影响,探讨H,S诱发大鼠疼痛形成的机制.
         材料和方法 
         1.动物选择及分组:清洁级雄性SD大鼠,7周龄,体质量180一200g,由河北医科大学实验动物中心提供大鼠饲养环境安静,室温20}250},自由进食水-待大鼠适应环境后,采用随机数字表法.将大鼠随柯[分为3组:对照组(C组),H=}I}(组)和氮叹酮组(K组升.
         2.模型制备及给药:S组和K组每天经后足底给子H,S的供体NaHS(美国Sigma-Alrich公司)1ntnol(生理盐水稀释至0.1ml),C组给予等体积生理盐水,1次/天,连续Sd,后1次足底给药后,测定机械缩足阂值,当17值低于49,为成功的疼痛模型然后开始肌肉注别给药,K组每天肌肉注射盐酸氯胺酮(江苏恒瑞医药股份有限公司,生产批号H32022820)10mg/kg(生理盐水稀释至0.2m1),5组和C组则同时给子等体积生理盐水,1次/天,连续7d.
         3.机械缩足I值(PWT)的测定:参照文献5,以足底给予NaHS或生理盐水时间点为标准,分别于足底给药前1d(T)、第1次足底给药后20min(T1)、第5次足底给药后20min(12)及肌肉注射后第7天(T3)测定PWT将大鼠置于底部带有金属网的有机玻璃箱中,待大鼠适应环境后,用一系列标准化的\VonFrey纤维丝(美国StoeltingWood公司)垂直刺激大鼠足底中心部位,使其弯曲成S形,持续8s,大鼠在刺激时间内或在移开vonFrey}纤维丝即刻发生快速的缩足反应为阳性反应,直至出现第1次阳性阴性(或阴性阳性)反应的骑跨,连续4次.采用Dixon-一介绍的方法计算50%缩足反应阑值为PWT.
         4取材:3组大鼠均在后1次PBX--T测定完成后腹腔注射苯巴比妥钠(上海新亚药业有限公司,生产批号H31020532)60m郭kg麻醉,取脊髓腰膨大部并迅速置于液氮中逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)法测定脊髓背角NR2BmRNA表达,Westernblot法测定脊髓NR2B蛋自表达,每种方法3组各采用5只大鼠进行测定.
         5.脊髓背角NR2BmRNA表达的测定:取脊髓膨大部组织50mg,采用Trizol总RNA提取试剂盒(北京艾德莱公司)提取总RNA采用紫外吸收法测定RNA浓度及纯度参照逆转录试剂盒(美国Fermentas公司)说明进行逆转录反应,20闪反应体系,反应条件为:420C60min,720C5min,PCR扩增反应体系为25p1o内参基因的(G}PDH)的反应条件为950C5min,36个PCR循环(940C30s;580C45s;72℃30s),72℃延伸5min_NR2B基ICI的反应条件为95℃5min,40个PCR循环(95〔30s;61℃1min;72〔30、),72℃延伸5min引物序列如下:GAPDH(252by)上游引物5'-A(:AGCAACAGGGTGGTGGA-3',下游引物50(W:AGCGAACTT-3'NR2B(475by);上游引物5'-}c-;GAAGCCACCTACATTTTTGA-3',下游引物5'-CGAGGCCACAC.}TAATACTTCA-3'0PCR引物均由北京赛百盛公司合成取PCR产物,经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定采用Quant沂One4.2软件进行分析,以目的基因灰度值与GAPDH灰度值的比值反映NR2B受体mRN.A的表达水平.
         6.Vesternblot法测定脊髓背角NR2B蛋白的表达水平:取脊髓背角在细胞裂解液中匀浆,分离提取L:"蛋白二喳琳甲酸(BC)法(试剂盒购自南京建成生物有限公司)测定样本总蛋白浓度.以50},g蛋白在gcJ}十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(sDS-PAGE.)胶上电泳分离后转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上.用5%脱脂牛奶封闭1h,在4℃条件下用NR2B抗体(英国Abcom公司,I:1000稀释)和件肌动蛋白((3-actin,美国SantaCruz公司,1:500稀释)孵育过夜,经TBST洗膜后于室温下加人辣根过氧化物酶标记的二抗溶液(美国SantaCru,公司,1=5000稀释)中孵育2h,增强化学发光(ECL)试剂盒显像.
采用UVP凝胶成像系统分析仪(美国UVP公司)采集图像,QuantityOne4.2软件进行分析,以目的蛋白灰度值与阶actin灰度值的比值反映NR2B蛋白的表达.
         7.统计学方法:应用SPSS13.0统计软件分析,正态分布的计量资料以均数士标准差(x1s)表示,组间比较采用单因素方差分析.
        

          结果
         与C组比较,S,K两组在T1及T2PST均明显降低(P<0.05);与S组比较,K组在T3PBX-T升高(P<0.05,表1).与C组比较,S组在给予NaHS7d后NR2BniRN表达明显增多(P<0.05);与S组比较,K组在给予7d氯胺酮后NR2BmRNA表达显著减少(P<0.05)3组大鼠脊髓背角NR2B受体mRNA表达变化见图1,表2.
         与C组比较,S组给予NaHS7d后NR2B蛋自表达明显升高(P<0.05);与S组比较,K组在给予氯胺酮7d后NR2B蛋自表达显著降低(P<0.05)〕3组大鼠脊髓背角NR2B受体蛋自表达变化见图2,表2.
         讨论
         在体内H,S在心血管,胃肠道,神经保护与毒性及疼痛调节中均发挥着作用,其作用靶点包括钙离子通道、钾离子通道、NMDA受体等.本研究结果显示,单次经足底给予NaHS20min后,大鼠PW7,明显下降,而连续给予NaHS5d后大鼠PW7{明显降低,且可持续至少1一2周.本研究结果表明,足底连续注射HZS后可致大鼠产生持续性痛觉过敏.
         氯胺酮是临床上应用较广泛的一类麻醉镇痛药.它是非竞争性NMDA受体的拮抗剂,主要作用于NMDA受体的苯环AjAi}}PCP)位点,从而拮抗NMDA受体的激活目前氯胺酮已广泛应用于临床镇痛,临床上小剂量氯胺酮的定义为一次肌肉注射量<2m剔kg,经静脉或硬膜外<1m郭kg,或经静脉持续输注速率蕊20N.,g/(kg"min)9我们采用临床上常用的肌肉注射方式,动物肌肉注射氯胺酮lOm到kg,其剂量经换算相当于临床患者肌肉注射1.5mg/kg,该剂量属于临床上小剂量氯胺酮的范畴.本研究结果显示,在HZS诱发的大鼠持续性疼痛中,氯胺酮重复肌肉注射可以使大鼠PITT升高,说明氯胺酮在一定程度上可以缓解HZS诱发的痛觉过敏.给予氯胺酮1周后大鼠脊髓背角NR2B的mRNA及蛋自表达水平均较S组下降,它说明氯胺酮可能通过抑制NR2B的表达产生镇痛效果.
         本研究结果表明,H,S诱发的持续性痛觉过敏可能与NR2B的上调相关,而氯胺酮可以抑制其表达,从而在一定程度上缓解H>S诱发的持续性痛觉过敏.
         参考文献 
         Tang G,Wu L,Wang R. Interaction of hydrogen sulfide with ion channels[J].Clin Exp Phannacol Physio1,2010.753-763.
         Kawabata A,Ishiki T,Nagasawa K. Hydrogen sulfide as a novel nociceptive messenger[J].Pain,2007.74-81.
Kimura H. Hydrogen sulfide:its production and functions[J].Experimental Physiology,2011.833-835.
         Boyce S,W yatt A,Webb JK. Selective NMDA NR2B antagonists induce antinociception withoutmotor dysfunction:correlation with restricted localisation of NR2B subunit in dorsal horn[J].Neuropharmacology,1999.611-623.
         Chaplan SR,Bach FW,Pogrel JW. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw[J].J Neuro Methods,1994.55-63.
         Dixon WJ. Efficient analysis of experimental observations[J].Ann Rev Phannacol Toxicol,1980.441-462.
         李亮,张近宝,白崇峰. 不同浓度硫化氢对离体大鼠心脏低温保存效果的研究[J].中华实验外科杂志,2007,(6):700-702.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2007.06.021.
         卢根林,闫兴军,邓勇. 硫化氢在肠缺血-再灌注损伤大鼠肝脏功能障碍中的作用[J].中华实验外科杂志,2010,(7):907-910.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2010.07.023.
         Schmid RL,Sandler AN,Katz J. Use and efficacy of low-dose ketamine in the management of acute postoperative pain:a review of current techniques and outcomes[J].Pain,1999,(2):111-125.doi:10.1016/S0304-3959(99)00044-5.