Kupffer细胞起源及其免疫学功能的研究进展

         （重庆医科大学附属第二医院肝胆外科，重庆400010） 摘要 Kupffer细胞(Kupffer cells，KCs)主要存在肝血窦中，是机体单核巨噬细胞系统的重要组成 部分。传统观点认为肝脏的KCs来是由单核巨噬细胞系统分化而来，但是新近研究发现具有分化 潜能的造血干细胞能被诱导分化为具有KCs功能的巨噬细胞o KCs通过模式识别受体(patternrecognition receptors，PRR)识别外源和内源的危险信号，激活后分化为M1型和M2型。在体内，硅化合物、脂质体封装混合物以及氯化钆类可以特异性消除KCs和（或）阻断KCs的功能o KCs的基本功能包括：吞噬清除病原；抗原递呈，启动适应性免疫；促进肝细胞再生等。 
         关键词 Kupffer细胞；细胞生物学；抗原递呈；肝细胞再生
         肝脏主要由肝动脉和门静脉营养。全身超过 3007c的血量流经肝脏，门脉系统占其中80%-肝脏还是人体大的免疫器官，发挥着清除外来毒素、介导机体固有免疫反应和激活并促进适应性免疫反应 的作用。Kupffer细胞(Kupffer cells, KCs)大量存在于肝血窦中，常见于肝脏小叶间静脉周围，并与血管 内皮细胞紧密相邻。肠道等器官的细菌（包括细菌产物）经门静脉系统流经肝脏，在肝血窦内易被KCs识别，并被KCs吞噬清除‘¨。KCs可通过较大的内皮窗孔进入Disse间隙，并通过旁分泌作用于肝细胞，调控肝细胞生理功能。KCs还在维持肝脏稳态 发挥重要的作用。 KCs的来源 KCs又叫肝脏固有巨噬细胞，占肝脏所有非实 质细胞的2007c~35%，占人体组织巨噬细胞的80~c~ 90070，是单核巨噬细胞系统的重要组成部分。 
         1876年德国解剖学家Kupffer在肝脏中发现一种可以被氯化金染色的细胞，并依据其星状外形称其为“Sternzellen”。Kupffer认为这是一种特异分化并具 有吞噬功能的内皮细胞，而1 898年波兰病理学家 Browicz等人则认为Kupffer所描述的细胞其实是巨 噬细胞0 1 974年iCVisse等人通过电镜和过氧化物酶染色进一步证实了Kupffer所描述的细胞为巨噬细 胞。他们发现该细胞主要存在于肝血窦内且与内皮细胞毗邻，并将其命名为“Kupffer Cells"。 KCs起源于红系一髓系祖细胞，在胚胎期起源于 卵黄囊，然后聚集和迁移到胚胎肝脏。在胚胎肝脏中，这种祖细胞在胚胎晚期进一步分化成胚胎巨噬细胞。随后，这些胚胎巨噬细胞逐渐被造血干细胞 分化的单核巨噬细胞取代，终分化为成熟的KCs。 而出生后，维持肝脏的巨噬细胞数量主要分为两种来源，一种是肝脏固有巨噬细胞( tissue resident mac— rophages)即KCs，另一种是肝脏从外周血募集的巨噬细胞( tissue-recruited macrophages)o传统观点认 为肝脏的KCs来源于骨髓组织，是由单核巨噬细胞系统分化而来的不可再生的巨噬细胞。相反，研究发现当肝脏部分切除后，KCs可以随着体内残余肝 组织的代偿性增生而出现自我增殖的现象。并且，在同时接受肝移植和骨髓移植的病例当中，当骨髓来源的单核细胞并未完全更新时，肝脏已经出现具有成熟的抗原递呈细胞存在并发挥作用。这些临床 现象都预示着KCs是一群具有自我更新能力并在 肝内分化成熟的巨噬细胞群或者由肝内KCs的祖细胞分化而来。而Liddiard等人在肝脏组织内发现了具有分化潜能的造血干细胞，他们在体外成功地将这种造血干细胞诱导成为具有KCs功能的巨噬 细胞( KCs-Iike macrophages)则进一步证实了KCs具有自我更新能力的观点。众所周知，在胚胎形 成期8—1 2周内，肝脏为主要造血器管：随后逐渐被骨髓所代替，至成年期，肝脏的造血功能停滞二但是，肝脏在某些病理情况下可恢复其造血功能，如慢 性失血，严重贫血与溶血二因而．肝脏内存在这种具有分化潜能的造血干细胞来维持机体的相对稳态，后天存在的KCs也有可能由这种具有分化潜能的造血干细胞进一步分化得来。Florent等人发现机 体在出生前就已经将前体巨噬细胞种植于对应的组丰国家自然科学基金( 31370753，81071339)资助课题织．这些前体细胞具有发展成为组织固有巨噬细胞的潜能，并且在。出生后肩负维持组织内固有巨噬细胞数量的重任。而Klein等人的研究表明由骨髓来源的单核细胞分化而来的KCs在肝内KCs更新过程中占据的优势，但是他们在肝脏免疫荧光检测中发现有大量的非骨髓来源的单核细胞分化的 KCs亚群的存在。他们还发现这两种不同分化来源的KCs具有相同的形态和吞噬能力。但是，在炎症反应中，只有骨髓来源的单核细胞分化而来的 KCs能够迅速激活并发挥相应的抗炎作用，非骨髓 来源的单核细胞分化的KCs亚群缺乏迅速局部募集和应答的能力。Bleriot等人认为细菌感染后能使 肝内KCs大量凋亡坏死，这是需要大量的骨髓来源的单核细胞分化来发挥肝内巨噬细胞抗细菌感染和组织修复作用。因此，不同来源的KCs在相关疾病的功能存在特异性。 
         二、生存周期 传统观点认为大鼠的KCs只能生存几个月。 但是，研究发现大鼠骨髓移植14~21天后，即可发
现供体来源的KCs。大鼠肝脏的KCs被脂质体一氯 磷酸盐( dichloromethylenebisphosphonate，C12MBP)特异性地消除14～16天后，可以观察到肝脏KCs的 完全再生。大鼠在肝移植后，受体的KCs在15~30天内可以完全替代供体的KCs。在人体肝移植 病例中，供体的KCs可以在受体肝脏内存活1年作用。由于各个研究团队研究的KCs种属来源不同而造成目前关于KCs生存周期的争议。 
         三、KCs的可塑性和极化
         KCs通过模式识别受体(pattern recognition re— ceptors，PRR)识别外源性和内源性危险信号。在受 到脂多糖( lipopolysaccharide，LPS)、干扰素1(inter— feron y,IFN-y)及白介素4（interleukin 4，IL-4）／IL一1 3的刺激时，KCs会出现M1和M2两种不同的激活分型，。这两种分型是根据巨噬细胞对辅助T细胞的激活途径来划分的。KCs的经典激活途径是 指巨噬细胞无抗原特异性激活Thl细胞，并被其分 泌的IFN一Y进一步活化，这种状态的KCs称为lV[1型oM1型KCs被IFN一Y和LPS／肿瘤坏死因子仪（tumor necrosis facto a，TNF一仪）激活，分泌大量的细胞因子如IL-I .IL-6.IL-12.TNF一仪，活性氧和活性氮等，并下调IL-10的表达，从而调控Thl型免疫应答、杀死细胞内病原体和抑制肿瘤生长等oTh2分 泌的IL-4和IL-13能选择性的激活巨噬细胞，提高其MHC II抗原的表达，清除细胞表面的甘露糖配 体，下调促炎症因子的表达等。这种Th2特异性激活后的KCs被称为M2型KCso M2型KCs还被j兰 一步分类为M2a型KCs. M2b型KCs. M2c≥ KCs‘o M2a型KCs主要被IL-4和IL-13激活，分泌大量的IL-IO和IL-I受体拮抗剂，过表达MHC II和 精氨酸受体，诱导IL-I受体II错配，又称为选择型 M2 KCsoM2b型KCs又称II型M2 KCs，主要被FIl受体和Toll样家族受体(toll-like receptor familyTLRs)7 IL-IR配体激活，分泌大量的IL-10.IL-6、11一1和TNF一a，并降低IL-12的表达。M2c主要被IL一1 0激活，分泌转化生长因子I3( transforming gro、、．tljfactor I3，TGF-[3) .11-10、多功能蛋白聚糖、抗胰蛋白 酶等。M2型KCs主要作用是参与Th2细胞免疫应 答发挥免疫调节作用、促进组织重构和肿瘤发展： 也有学者把体外受GM-CSF-1刺型。它们分泌不同 的细胞因子，表达不同的抗原决定簇‘8]。其中ED1和ED2是常用的两种区分KCs细胞分型的表面 标志物，EDl+ KCs和ED2+ KCs在肝脏组织内含量的变化可能会导致机体内促炎症因子和抗炎因子失衡，造成肝脏组织直接或间接损伤。
          四、KCs免疫学功能 KCs作为人体大的巨噬细胞群，在病理状态 下发挥重要的作用，如在脓毒血症中，KCs既清除病原体以减轻机体感染，又有可能加重全身性炎症反应综合征，更甚者导致多器官功能衰竭等；而KCs在接受小剂量细菌产物（如LPS）刺激后，再次接受大剂量LPS刺激时炎症级联反应并未明显，这可能 与机体内毒素耐受保护机制相关，而KCs内TLR4信号通路在调控内毒素耐受机制起着关键的作用：急性重症胰腺炎发生时，大量激活的细胞因子经门静脉入肝内循环激活KCs，激活的KCs释放大量的 TNF一a是进一步扩大胰腺炎导致的器官功能衰竭的主要原因之一；而在乙肝病毒和丙肝病毒感染的活 跃期，肝内KCs的数量明显较病毒静默期高，且主 要集中在炎症坏死明显的汇管区，因此，KCs在肝病 中既能吞噬病毒颗粒，由加重局部肝组织的坏死，在 促进肝纤维化的过程中发挥重要的作用；而由酒精和肝脏脂肪代谢紊乱引起的肝病中也发现酒精或者 游离脂肪酸能够加剧LPS介导的肝脏损伤，而LP:,介导的肝脏损伤主要是通过激活KCs的TLR4和炎症小体信号通路起作用，KCs在进一步发展为肝纤维化和肝硬化过程中具有关键的调节作用；KCs是 机体防御的主要效应细胞，KCs通过抗原递呈激活 细胞免疫以及分泌TNF一仪等间接和（或）直接参与杀伤肝癌细胞；肝移植是目前治疗各种终末期肝病 有效的手段，但术后缺血再灌注损伤和免疫排斥反应是影响肝移植生存率和患者预后的主要难题， 而KCs吞噬清除及抗原呈递的能力可以有效的调节肝移植后两种叠加式反应，进而影响整个移植肝脏的存活。KCs在上述的病理情况下的作用机制已 经有较全面的报道，本文将不再赘述。
          （一）吞噬清除病原 门静脉收集了肠道的静脉血，其中可能包含各种细菌及其碎片、衰老及有缺陷的红细胞和肠道毒素等。KCs并不能像其他巨噬细胞一样主动寻找病原体，它只附着在肝脏的血管 内皮细胞周围，伺机捕获随血液流动的病原体c血流在肝血窦里速度缓慢，使得KCs有更多的机会与 病原体接触。这些病原与KCs表面相应受体结合后，激活KCs并促进KCs产生一系列的细胞因子和趋化因子。因此，KCs像哨兵一样，在病原体入侵时 迅速唤醒人体免疫系统。如果去除体内的KCs，病菌在体内存活时间延长，严重者机体将会出现严重 的细菌感染甚至死亡，表明KCs具有保护机体的 ：能‘9]oKCs可以捕获病原体，通过内吞作用清除病原体，还可以通过其他途径消灭病原体。如KCs通过识别李斯特杆菌，将它们粘附于细胞外，同时募集中 性粒细胞，两者结合相互作用并杀灭病菌。还有研究发现抑制KCs的活性后，脾脏和肺有大量中性粒细胞聚集。而且KCs还可以通过粘附作用清除过 多活化的中性粒细胞或者凋亡的中性粒细胞。可见，KCs在炎症反应前期可以通过募集中性粒细胞发挥促进炎症发展，但是在炎症反应后期KCs又将反应过剩或者持续激活的中性粒细胞清除，以阻止其释放炎症因子，从而达到减轻炎症的目的‘10]n因 此，KCs具有维持自身内环境稳态和修复组织的 作用。 
        

         （二）抗原递呈，启动适应性免疫 KCs也是重 要的抗原递呈细胞（antigen presenting cell, APC）。 KCs表面表达抗原递呈必备的分子如主要组织相容性复合体I( rnajor histocornpatibility complex I，MHCI) .MHC II、共刺激分子和粘附分子等。虽然KCs能迅速激活T细胞，但是在正常生理条件下，KCs抗 原递呈能力明显较其他APC弱，它只能激活少量 的T细胞，几乎无法相应的启动适应性免疫反应‘11 1 0 KCS的这种特性与肝窦内皮细胞(liver slnu— soidal endothelial cells，LSECs)相似。两者均长期接 触肠道来源的病原体，为了维持机体稳态和避免过 度的炎症反应对自身的伤害，它们在正常生理条件下自动地减弱自身的抗原递呈作用。但是，一旦受到INF-一y等刺激时，KCs可通过与表面的PRP协作， 发挥其抗原递呈细胞的作用，迅速激活T细胞并启动适应性免疫反应‘12] n虽然在正常情况下，KCs活 化T淋巴细胞的能力较弱，但是KCs激活固有自然 杀伤T淋巴细胞( invariant nature killer T cells． iNKT)的能力却是非常迅速和强大。当KCs捕获病 原体时，就可以迅速将其处理后的抗原信号通过其 表面的CDld递呈给iNKT[1 3]o（三）KCs促进肝细胞再生 肝部分切除后，多种细胞参与肝脏再生过程。三氯化钆( gadoliniumchloride，GdC13)去除KCs后再行部分肝切除的大鼠 模型中，大鼠术后肝细胞再生时间明显比正常部分肝切除大鼠肝再生时间短。这表明KCs能分泌某种细胞因子抑制肝细胞的再生。但是，有研究认为 GdC13并不能完全去除KCs，所以没有足够的证据说明KCs对肝脏再生有抑制作用‘141。相反，有研究 认为IL-I-7能够增强KCs过表达TNF一仪来调控肝细胞再生过程‘15]oYang等人认为KCs是分泌wnt因 子主要来源，在肝切除后KCs主要通过控制wnt的 分泌来激活连环素蛋白I3促进肝再生‘15 3 0另外，他们还发现KCs在启动肝细胞增生的过程发挥关键 性作用。Yoshiya等人用F13A抑制大鼠体内血管 紧张素受体AT1相关受体蛋白的内源性受体apelin
再行肝切除后，KCs迅速被激活并分泌大量的TNF— d和IL-6促进肝细胞再生‘16]oMurata等人则认为，肝切除后血小板损伤颗粒可以直接激活KCs，使后 者通过分泌IL-6来激活信号传导因子及转录激活 因子3来促进肝细胞再生‘17 1 0以上的证据均证实了KCs参与了肝细胞再生的过程，但是KCs在肝细 胞再生过程中是否扮演发起者的角色仍存在比较大的争议，KCs调控肝细胞再生过程的机制尚未清楚。 
         五、KCs的消除和功能阻断20世纪70年代至今，研究者尝试用不同的方法消除体内KCs或者抑制KCs的功能。目前，广泛
的运用于KCs实验研究的化合物主要为硅化合物，脂质体封装混合物和氯化钆类。 硅化合物主要包括二氧化硅( silica)、石棉(as— bestos)等，它们能够有效地封闭KCs单核巨噬细胞系统，抑制KCs的吞噬与代谢功能。但是，目前研 究发现硅化合物对体内各个器官的巨噬细胞以及淋巴细胞均有抑制作用，并且不能完全封闭体内的 KCs功能。另外，硅化合物极易激活KCs的免疫活性，分泌IL-I等细胞因子等，所以硅化合物已逐渐被后两者替代‘18]n脂质体封装混合物主要包括C12MBP，脂质体／ 卡拉胶( liposomes-carrageenan)等，其中C12MBP是 目前广泛应用于消除体内KCs的方法之一。 C12MBP被KCs摄人，外膜脂质体被溶酶体破坏，释放氯膦酸盐，当胞内的氯膦酸盐到达一定浓度时， KCs就会裂解，而氯膦酸盐则迅速被肾脏代谢。 C12MBP的优点主要包括：脂质体主要被KCs摄人； 进入细胞后，脂质体的双层被溶酶体分泌的磷酸酶破坏，释放携带的氯膦酸盐；胞内的氯膦酸盐不容易 通过细胞膜；从死亡的KCs释放的氯膦酸盐不易被非巨噬细胞摄入，且体内代谢半衰期极短。 C12MBP消除KCs机制主要包括ATP合成障碍，胞内铁耗竭以及细胞钙流失等一19：n氯化钆类主要包括GdC13，三氯化钆六水合物 (GdC13. XH20)等o GdCl3进入KCs能够特异性封闭单核巨噬细胞系统，使正常的KCs以及处于免疫活性状态的KCs的吞噬功能失活oGdC13作用的主要机制替代KCs细胞膜上钙离子，从而抑制KCs的 吞噬功能oGdC13优点是口服给药和机体极少产生免疫反应
         六、结语 KCs作为人体内重要的单核巨噬细胞的组成部分，在维持正常机体内环境稳态和抵御外来病原体 入侵发挥重要的作用：KCs像哨兵一样，在病原体入侵时迅速唤醒人体免疫系统，发挥抗原递呈作用， 启动适应性免疫反应：在肝细胞再生过程中，KCs细胞通过分泌的TNF一a和IL6能够刺激肝细胞再生。因此，深入研究KCs的细胞生物学基础以及KCs在肝脏疾病发生机制的作用，能够为肝脏疾病的治疗提供新的思路。 
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