青霉素发酵菌种、工艺流程与要点及过程控制

青霉素是一类抗菌药物，能攻击多种细菌。他们是医生们使用的第一批此类药物。青霉素的发现和制造改变了医学的面貌，因为这些药物拯救了数百万人的生命。青霉菌是青霉素的来源，人们可以口服青霉素类药物或注射青霉素。现在，全球各地的人们广泛使用青霉素来治疗感染和疾病。那么青霉素是怎么发酵的呢？下面为大家讲解青霉素发酵菌种、工艺流程、工艺要点及过程控制。



1．青霉素发酵采用的菌种

发现产生青霉素的原始菌种得英国科学家茀莱明分离的点青霉，合成能力低下，沉没培养时只能产生2U/mL，远远不能满足工业生产的要求。后来找到另一种生产能力较强且适合液体深层培养的产黄青霉菌种，并再经X射线、紫外线诱变处理，得到生产能力较高的菌种，生产能力可达1000一1500U/mL。顾名思义，产黄青霉容易产生大量的黄色素，且分离时不易除去，故再将此菌进一步诱变处理，使其产生黄色素的能力丧失后，才成为世界通用的生产菌种。现代分子生物学方法的发展，为青霉素菌种的改进提供了新的契机，结合基因工程技术和发酵工艺的改进，使当今世界青霉素工业发酵水平已达85000U/mL以上。


国内大多数生产厂都采用绿孢子丝状菌。细胞生长发育分为6期：Ⅰ－Ⅲ长菌丝为主；Ⅲ－Ⅴ合成产物为主；Ⅵ放罐。


青霉素生产中，菌种是活的灵魂，对菌种的保藏至关重要。国内生产厂家一般在真空干燥状态下保存其分生孢子。也可用甘油或乳糖溶液作悬浮剂，在一70℃冰箱或液氮中保存孢子悬浮液或营养菌丝体。由于分生孢子在保存过程中较营养菌丝体更易变异，故保存营养菌丝是青霉素生产菌种保存。


2．青霉素发酵工艺流程、工艺要点及过程控制


（1）丝状菌三级发酵工艺流程


冷冻管（25°C，孢子培养，7天）——斜面母瓶（25°C，孢子培养，7天）——大米孢子（26°C，种子培养56h,1:1.5vvm）——一级种子培养液（27°C，种子培养，24h,1:1.5vvm）——二级种子培养液（27~26°C,发酵,7天,1:0.95vvm）——发酵液。


种子制备阶段包括孢子培养和种子培养两个阶段。孢子培养以获得丰富的孢子(斜面孢子和米孢子)为目的；种子培养以获得大量健壮的营养菌丝体(种子罐培养)为目的。孢子和种子质量对青霉素的产量有直接影响，必须对其生产过程的每一环节严格控制。


(2)工艺要点


a生产孢子的制备斜面孢子培养基：甘油、葡萄糖和蛋白胨。孢子培养基：大米或小米固体培养基，培养条件是在无菌条件下25℃培养7天。成熟的孢子进行真空干燥后，低温保存备用。


b生产种子的制备青霉素生产种子常用二级种子罐培养。第一级种子罐接入孢子，接种量为每立方米培养基不少于200亿孢子。培养基组成为玉米浆、乳糖和葡萄糖等。培养条件为27±1℃培养40h图2—2青霉素生产一般流程图


左右，控制通气量为1：3m3/(m3?min)，搅拌转速为300~350r/min。一级种子培养温度高于青霉菌的生长和生产温度，主要是为了促进孢子的萌发。


二级种子培养时接入10%一级种子，以葡萄糖和玉米浆等为培养基，培养温度25±1℃，培养时间10~14h，通风比(1：1)~(1：5)m3/(m3?min)，搅拌转速为250~280r/min。


种子质量要求：菌丝稠密，菌丝结团很少，菌丝粗壮，有中小空胞。在生长条件下，达到对数生长期时菌丝体量的培增时间约为6~7h。菌种保存时间过长、上一级种子生长不良、原材料质量发生波动等，都将影响菌体生长速度，使倍增时间延长。在工业生产中，培养条件及原材料质量均应严格控制，以保持种子质量的稳定性。


c发酵生产发酵以葡萄糖、花生饼粉、麸质水、尿素、硝酸铵、硫代硫酸钠、苯乙酰胺和碳酸钙为培养基。发酵阶段的工艺要求见表2一1。



对于分批发酵来说，这一过程又分为菌体生长和产物合成两个阶段。前一阶段菌丝体快速大量生长。由生长阶段转入产物合成阶段的必要条件是菌丝体的比生长速率降低到一个合适的水平，这可通过降低葡萄糖浓度的方法来间接控制。为了维持青霉素的持续合成能力，在合成阶段，需要维持菌丝体处于低比生长速率。在转入合成阶段时，菌丝浓度不宜过高，以确保生产期菌丝体浓度有继续增加的余地。


发酵时的接种量约为20%，发酵温度先期为26℃后期为24℃，通气量为1：(0.8~1.2)m3/(m3?min)，搅拌速度为150~200r/min。


表2一1青霉素发酵的一般工艺要求


①标准状态下的空气流量。


发酵过程必须适当加糖，并补充氮、硫和前体。加糖时要控制好残糖量，前期和中期约控制在0.3~0.6%范围内，加入量主要决定于耗糖速度、pH值变化、菌丝量及培养液体积。


pH值控制：一般，前期60h内维持pH值6.8~7.2，以后稳定在6.5左右。部分菌种，例如产黄青霉绿色孢子，pH值则始终在6.4~6.5范围内，高于7.0或低于6.0则出现代谢异常，青霉素产量下降。


泡沫控制：前期泡沫主要是花生饼粉和麸质水引起的，在前期泡沫多的情况下，菌丝体需氧量也低，可通过间歇搅拌来控制；中期泡沫可通过加油(消泡剂)来控制，必要时可略为降低通气量，但搅拌必须开足，否则会影响菌体呼吸。发酵后期产泡沫的量一般很少，勿需特殊控制。


发酵时间应从三个方面考虑：累计产率(发酵累计总亿产量与发酵罐容积及发酵时间之比值)高；单产成本(发酵过程的累计成本投入与累计总亿产量之比值)低；发酵液质量好(抗生素浓度高，降解产物少，残留基质少，菌丝自溶少)。这三个方面在发酵过程中的变化往往不同，须根据生产全局综合考虑，进行适当折中。


（3）过程控制


影响青霉素发酵产率的因素包括温度、pH值、基质浓度、溶氧饱和度、菌丝浓度、菌丝生长速度、菌丝形态等等。在发酵过程中，要对这些因素严格控制在适当的范围内，才能获得理想的发酵产率。


a碳源控制生产用青霉菌能够利用的碳源有乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等，但各碳源对青霉素产量的影响不同，其中乳糖是合成青霉素好的碳源，葡萄糖次之。在生产过程中，利用乳糖的成本较高，只能用退而求其次，选用葡萄糖，但必须严格控制其浓度。乳糖之所以是青霉素合成好的碳源，主要是由于菌体进行乳糖的代谢速度与菌体的合成速度相适应，不会产生中间代谢产物的积累。葡萄糖则不同，由于属于快速利用的碳源，其代谢速度要比菌体的合成速度快，导致部分中间产物的积累，从而抑制青霉素合成酶的合成。在中前期，葡萄糖的适浓度是0.3~0.6%，超过此范围，将严重抑制青霉素合成酶的合成，从而导致青霉素合成能力的下降。低于此范围，由于菌体营养不足，呼吸受阻，使菌体过早衰老甚至自溶，同样会导致青霉素产量的下降。目前，葡萄糖的在线检测还存在一定困难，必须取样后用廉-爱农法滴定分析。葡萄糖的控制不是根据其浓度进行控制的，而是根据pH值、溶氧或CO2释放率予以调节。


b前体控制前体主要是指用来合成青霉素分子上含苯环基团的侧链的苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等。青霉菌即可将前体直接结合到青霉素分子中，也可作为养料和能源利用，即氧化为二氧化碳和水。前体究竟通过哪个途径利用，主要取决于培养条件以及所用菌种的特性。早期采用的Q176菌株，将大部分前体(71%~94%)氧化消耗掉，只有2%~10%转化为青霉素。而现代工业生产所用的菌种，前体转化率为46%~90%，为了避免前体加入浓度过大而对菌体产生不利影响，除基础料中加入0.07%外，其余按需要同氮源一起补入。


前体对青霉菌的生长发育有毒性，其毒性大小取决于培养基的pH值和前体的浓度。苯乙酰胺在碱性时毒性较大，pH=8时即抑制菌体的生长；苯乙酸在酸性(pH5.5)时毒性较大，碱性时不抑制菌丝体生长；pH在中性时苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。前体用量大于0.1%时(除苯氧乙酸外)，青霉素的生物合成均会下降，尤以苯乙酰胺更甚。一般认为发酵液中发酵液中前体的浓度始终维持在0.1%为宜。


前体的氧化速度除与培养基的pH有关外，也与菌龄有关，苯乙酸被菌体氧化的速率，随培养基pH上升而增加。年轻的菌丝不氧化前体，而仅利用它来构成青霉素分子。随着菌龄的增大，氧化能力渐渐增强。


培养基成分对前体的氧化程度有较大影响，合成培养基比复合培养基对前体的氧化量少。这可由前体氧化的中间产物，即邻羟基苯乙酸，在培养基中的积累得到说明。摇瓶实验发现，在通气条件差的情况下，菌体氧化前体的能力降低。另外，将培养在含葡萄糖或乳糖培养基上的菌丝与不含糖的培养基上的菌丝转移到缓冲液(三天菌龄)中，对青霉菌氧化前体的能力进行测试比较，发现前者比后者减弱一半。为了尽量减少苯乙酸的氧化，生产上多用间歇或连续添加低浓度苯乙酸的办法，以保持前体的供应速率仅略大于生物合成的需要。也有人研究用蔗糖和苯乙酸钠盐压成的片剂来给青霉素摇瓶发酵进行间歇补料，这种片剂的内含物在溶液中缓慢释放，可控制其释放时间和速度。采用这一方法进行的摇瓶试验，发酵9天后发酵液中青霉素的效价达16150u/mL，而对照组的效价仅6700u/mL。


③pH的影响及控制：青霉素发酵的适pH，一般认为是6.5~6.9，应尽量避免超过7.0，因为青霉素在碱性条件下不稳定，容易加速消解。在缓冲能力较弱的培养基中，pH变化是葡萄糖流加速度高低的指征。但在缓冲能力较强的培养基中，这种控制应pH反应不灵敏而不十分可靠。在青霉素发酵中pH是通过下列手段控制的：如pH过高，可添加糖、硫酸或铵盐；pH较低可加入CaCO3、NaOH、氨或尿素，也可提高通气量。也有利用自动加入酸或碱的方法，使发酵液pH维持在适范围，以提高青霉素产量。


用补糖来控制pH比用酸、碱来调节好。一种是恒速补糖，用酸或碱来控制pH；另一种是根据pH来补糖，即pH上升得快就多补，pH下降时少补或不补，以维持pH6.5~6.9范围。实践发现，后一种方法对提高青霉素产量更为有利，既能满足青霉菌在不同阶段对糖的需要，又能控制pH在适范围内。前一种方法虽然也能控制pH，但满足不了菌体代谢和合成青霉素的需要，可能导致菌体的代谢向不利于青霉素合成的方向变化。


④温度的影响及控制：青霉素发酵的温度随所用菌株不同可能稍有差异。对菌丝生长和青霉素合成来说，所要求的温度是不一样的。一般生产的适宜温度为27℃，而分泌青霉素的温度在20℃左右。在青霉素合成期，如温度过高，明显降低发酵产率，同时增加葡萄糖的维持消耗，降低葡萄糖至青霉素的转化得率。生产上采用变温控制法，使适合不同发酵阶段的温度需要。如采用从26℃5.55.55.5是逐渐降低至22℃，可延缓菌丝体衰老，延长发酵周期，增加培养基中的溶氧，提高青霉素产量。


e溶氧控制溶氧是影响青霉素产量的重要因素。一般要求溶氧饱和度高于30%，如过低，青霉素产率急剧下降；若低于10%，将造成不可逆的损失。发酵液中溶氧过高，说明菌丝生长不良或营养不足，同样会导致生产能力下降。


f其它营养成分控制氮源也是青霉素发酵的关键。开始时，培养基中的铵浓度要达到35g/L为宜。一般在基础料中加入0.05%的尿素，而后在补糖时，再逐渐补充部分尿素，有利于提高青霉素产量。另外，在发酵液中加少量聚乙烯醇、聚丙烯酸钠等可溶性高分子化合物，可以防止菌丝体因搅拌被打断，也可防止菌丝体结团，从而可使青霉素的产量增加38%。


g铁离子控制发酵液中的三价铁离子浓度对青霉素合成有影响。当三份铁离子浓度超过30~40μg/mL时，青霉素合成速度明显减缓。要控制铁离子浓度，除了注意培养基配比和水质外，还要防止铁质容器内壁上的可溶性铁离子溶解到发酵液中来。一般要将铁质容器壁涂以环氧树脂等保护层。



（5）菌丝浓度发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度,从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度(取决于维持因数的大小,维持因数越大,呼吸强度越高)、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升,从而提高临界菌体浓度。


（6）菌丝生长速度用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比,当比生长速率高于O.015h-1时,比生产速率与比生长速率无关D因此,要在发酵过程中达到并维持大比生产速率,必须使比生长速率不低0.015h-1。这一比生长速率称为临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说,维持0.015h斗的临界比生长速率意味着每46h就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍,这在实际工业生产中是很难实现的。事实上,青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多,却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶,抵消了一部分生长,故虽然表观比生长速率低,但真比生长速率却要高一些。


（7）菌丝形态在长期的菌株改良中,青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触,故一般比生产速率较高；后者则由于发酵液黏度降低,使气-液两相间氧的传递速率大大提高,从而允许更多的菌丝生长(即临界菌体浓度较高),发酵罐体积产率甚至高于前者。


在丝状菌发酵中,控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度,并避免结球,是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中,使菌丝球保持适当大小和松紧,并尽量减少游离菌丝的含量,也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。


g.发酵液质量控制生产上按规定时间从发酵罐中取样,用显微镜观察菌丝形态变化来控制发酵。生产上惯称"镜检",根据"镜检"中菌丝形变化和代谢变化的其他指标调节发酵温度,通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时间,以获得多青霉素。当菌丝中空泡扩大、增多及延伸,并出现个别自溶细胞,这表示菌丝趋向衰老,青霉素分泌逐渐停止,菌丝形态上即将进入自溶期,在此时期由于茵丝自溶,游离氨释放,pH值上升,导致青霉素产量下降,使色素、溶解和胶状杂质增多,并使发酵液变蒙古稠,增加下一步提纯时过滤的困难。因此,生产上根据"镜检"判断,在自溶期即将来临之际,迅速停止发酵,立刻放罐,将发酵液迅速送往提炼工段。