细胞-细胞相互作用检测策略

在多细胞个体中，组织形成，神经传递以及免疫响应等细胞间结合的生理过程中涉及细胞-细胞相互作用（CCIs, cell-cell interactions）。CCIs产生或传递的生理信号可通过膜表面蛋白以接触另一细胞表明受体的方式或者通过分泌化学信号的方式进行。在细胞间信号传递时，CCIs发生的过程高度动态、参与的组分也十分复杂。因此，解开CCIs中组成成员间千丝万缕的关系，阐明其相关的信号通路，可帮助人们理解CCIs对人体健康与疾病的重要性，并促进临床开发与细胞间通信相关的免疫疗法。

目前，研究CCIs的方向主要有细胞成像，邻近驱动化学标记，单细胞测序以及功能开发等。本篇综述文献主要围绕显微镜成像与化学标记两种研究CCIs方法进行介绍，这些技术主要回答以下问题：

① CCIs在何处发生？

② 发生CCIs的结构基础是什么？

③ 哪些细胞会直接进行接触式相互作用？在作用过程中有什么生物分子参与？

01细胞-细胞相互作用显微镜成像策略

随着显微镜技术与细胞表面检测方法的发展，CCIs界面相互作用的动态可视化成为可能。本章节内容将重点强调荧光报告基团在CCIs研究中细胞成像的应用研究（图1）。

1.黏附于玻璃板上的平面脂质双分子层（SLBs）

在SLBs加入荧光标记的蛋白质后，借助显微镜技术针对蛋白质运动进行成像，研究CCIs界面的配体-受体相互作用动力学。该技术已被成功应用于免疫突触动力学，研究T细胞表面的超分子激活簇（SMACs，supramolecular activation clusters）。

2.正交多色成像探针

利用具备高荧光检测信号、标记选择性的荧光染料-蛋白偶联物（例如，荧光标记的链霉亲和素mSA或者荧光标记的纳米抗体）作为成像探针，可帮助提高细胞界面的成像分辨率。这类探针有助于细胞界面结合动力学研究中的正交靶向与多色成像。

3.蛋白质片段互补

在相互作用的细胞表面上分别表达蛋白质片段来探索细胞-细胞相互作用。例如跨突触的GFP蛋白片段重组（GRASP）方法中，利用两个非荧光状态的GFP蛋白片段检测CCIs的相互作用时，当细胞发生紧密接触时，两个蛋白质片段重组后由非荧光切换为荧光状态，实现细胞间相互作用成像。该方法已被用于研究小鼠海马神经元中突触间的相互作用。

02 细胞-细胞相互作用化学标记策略 在CCIs界面实现标记探针的激活可以了解到哪些细胞发生相互作用以及细胞界面上出现哪些蛋白质与其他生物分子。化学标记策略通过激活在细胞表面附着酶或者小分子催化剂的方式定位标记膜表面邻近的生物分子，利用生物素-链霉亲和素富集后再利用质谱、凝胶成像以及流式细胞仪等方式进行检测分析。 化学标记策略可依据诱饵细胞与猎物细胞的诱导标记是否需要物理相互作用分为接触依赖标记与无需接触标记两种技术，接下来将继续讨论这两种策略：

1.细胞-细胞相互作用的接触依赖标记

接触依赖标记方法通常需要细胞表面的酶与邻近细胞膜表面的底物发生直接接触，随后通过酶催化激活生物素探针标记邻近细胞膜表面的受体底物上。这种标记方式基于酶与受体底物的物理接触，可保证较小范围的标记半径。

分选标记细胞间接触实现免疫细胞相互作用标记（LIPSTIC）与酶催化的邻近细胞标记（EXCELL）LIPSTIC策略的原理来自金黄色葡萄球菌的分选酶SortaseA（SrtA）能催化分选肽（LPETG）与寡聚甘氨酸（G5）受体肽产生共价连接。该方法通过在已知相互作用的细胞膜表面分别表达SrtA与寡聚甘氨酸（G5）受体肽，通过被激活后SrtA将分选肽上的生物素标签转移至受体肽上，实现CCIs的捕捉。该研究成功已应用于检测小鼠树突细胞与T细胞的CD40-CD40L相互作用。 后续，北京大学陈鹏课题组通过定向进化得到了mgSrtA,该工程酶可识别待标记细胞表面蛋白上的单甘氨酸并实现与分选肽的共价标记，由此提出能够针对任意未知CCIs界面进行标记的酶催化的邻近细胞标记（EXCELL）策略，实现了细胞相互作用的原位标记与捕获。

2.细胞-细胞相互作用的无需接触标记

无需接触标记方法通常利用酶催化或者小分子催化剂在诱饵细胞膜表面产生高反应活性标签分子，这类标签分子可随机扩散至细胞周围环境中，由此实现对CCIs界面邻近的猎物细胞标记，其标记效果由活性中间体的半衰期、分子浓度、标记时间以及细胞微环境相关。

这类方法实例主要有：①APEX策略：过氧化物酶在过氧化氢的存在下，利用生物素苯酚生成活性标签，实现在神经元突触之间的蛋白-蛋白相互作用（PPIs）标记（图7b）；②BioID策略：生物素连接酶催化生物素Biotin与ATP，形成Biotin-AMP生物素实现CCIs界面相互作用蛋白质的生物素化标记（图7c）；③mMap策略：利用光氧化还原催化体系，在细胞膜表面生成半衰期较短的卡宾活性中间体生物素标签，相比于酶促生成的活性中间体，可实现更好的时空分辨率。目前该策略已被实现免疫细胞膜表面标记，展示了光催化剂在化学标记CCIs的应用潜力。

总结

细胞-细胞相互作用的发生过程高度动态，其中暗藏的生理过程与个体健康密切相关。探索CCIs研究技术的发展将向人们在分子水平上解开CCIs的神秘面纱，助力细胞治疗策略的开发。本篇推送主要介绍了综述中提及的CCIs研究技术前沿进展，强烈建议对此感兴趣的读者阅读原文献学习更深入的干货。