肠道微生物组介导的降低胆固醇水平的机制

1 CVD、胆固醇和肠道微生物群

心血管疾病是一种危及生命的疾病，也是全世界死亡的主要原因。胆固醇水平升高被认为是心血管疾病的风险因素、生物标志物和预测因子，因为沉积在血管壁中的胆固醇可以减少或阻断血液流动和氧气运输。高胆固醇血症一直与动脉粥样硬化、心力衰竭或高血压等形式的心血管疾病风险增加相关；它还会对其他疾病产生不利影响，如糖尿病、肝病和阿尔茨海默病。在哺乳动物中，胆固醇主要在肝细胞和肠道中合成，也可以从膳食成分中获得；肝细胞分泌1 g胆固醇，人类饮食每天提供约0.4 g胆固醇。这些来源的胆固醇以脂蛋白形式存在，主要在十二指肠和近端空肠中吸收，并通过循环输送到各种器官和组织。根据密度，脂蛋白分为四种类型：高密度脂蛋白(HDL)和非高密度脂蛋白，其中非高密度脂蛋白分为极低、中等和低密度脂蛋白(VLDLs、IDLs和LDLs)。非高密度脂蛋白将脂质从肝脏运输到外周组织。相反，高密度脂蛋白将胆固醇从外周组织转移到肝脏，这一过程称为胆固醇逆向转运(RCT)。由于脂蛋白的密度与胆固醇的运输有关，高密度脂蛋白胆固醇被认为对动脉粥样硬化的发展具有保护作用，而低密度脂蛋白是有害的。在临床试验中，他汀类药物被用于抑制肝细胞中的胆固醇合成并降低血清胆固醇水平。依泽替米贝，一致肠道胆固醇吸收抑制剂，也被广泛用于降低胆固醇水平。因此，调节胆固醇代谢是降低胆固醇水平的一种切实有效的策略。

近几十年来先进的元组学研究为了解人类微生物群如何改善人类健康开辟了新的途径。微生物组与CVD之间的联系是广泛的研究之一。一项使用高胆固醇血症小鼠的研究表明，抗生素导致肠道微生物群减少，导致肝细胞胆固醇摄取和合成增加。同一研究还表明，将血浆胆固醇水平升高的个体肠道菌群移植到小鼠体内会导致胆固醇水平升高。这表明肠道微生物群可以调节胆固醇代谢，并且通过涉及肠道微生物群的干预措施(如粪便微生物群移植、抗生素、益生菌和益生元)降低胆固醇水平是可行的。

2014年，国际益生菌和益生元科学协会将益生菌定义为“活微生物，当给予足够的量时，会给宿主带来健康益处”。益生菌被公众广泛接受，并用作功能性食品或补充剂；某些含有乳酸杆菌和双歧杆菌的益生菌可用于降低宿主体内的胆固醇水平。在过去的二十年中，下一代测序(NGS)使已知对宿主健康具有潜在益处的微生物范围大幅扩大。由于这些NGS的发展而鉴定出的这些微生物有时被称为NGP，也被称为活生物治疗产品(LBP)。NGP被定义为“通过比较微生物群分析确定的活共生微生物，当以足够的量给药时，对宿主健康有益”。这些微生物主要来自阿克曼氏菌属(Akkermansia)、拟杆菌属(Bacteroides)和粪杆菌属(Faecalibacterium)。肠道微生物群与心血管疾病和胆固醇代谢的关联已在以前的综述文章中讨论过(BOX 1)。然而，肠道微生物及其代谢产物在降低胆固醇水平方面的潜在机制和药物作用尚未得到详细综述。本综述总结了微生物群降低胆固醇水平的分子机制，然后描述了NGPs的降胆固醇功能。本综述旨在提供研究团体可用于指导NGP作为CVD治疗方法的发现、使用和开发的机制信息。

BOX 1. 肠道微生物群与心血管疾病之间的联系。

心血管疾病与生活方式、饮食和肠道微生物群有关。肠道菌群失调已在几种类型的CVD中被观察到，如心力衰竭、动脉粥样硬化性CVD、高血压、缺血性发作、心脏病发作和中风。例如，心力衰竭与E. rectale和F. prausnitzii数量减少以及大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和Streptococcus viridans数量增加有关。在分子水平上，肠道微生物群产生的代谢物的变化比分类水平上的变化与CVD的关系更密切。在这些代谢物中，氧化三甲胺(TMAO)、短链脂肪酸(SCFA)和胆汁酸(BAs)水平与CVD相关。升高的TMAO水平通过降低RCT、改变胆固醇和BA代谢、激活炎症信号、加速泡沫细胞形成和引起血小板过度活化等方式增加冠状动脉疾病(CAD)发生的风险。鉴于TMAO的这些破坏性作用，临床前研究探索了3,3-二甲基-1-丁醇对其产生的抑制作用，以治疗动脉粥样硬化。相反，肠道微生物群产生的SCFA对心脏代谢健康具有有益影响，并通过调节代谢和免疫稳态以及维持肠道屏障功能来预防CAD的发展。复杂的BA池也与心血管疾病风险相关。基于细胞和动物的研究表明，疏水性次级BAs似乎具有心脏毒性作用，而亲水性BAs具有心脏保护作用。这些数据表明，TMAO会使CVD恶化，而SCFAs和BAs可能有助于其治疗。因此，总结SCFA、BAs和其他分子的降胆固醇机制可能有助于扩大能够降低胆固醇水平的微生物的使用范围，并有助于开发新型和临床上有用的微生物。

2 肠道微生物群和NGPs的降胆固醇机制

如BOX 1所述，肠道微生物群及其代谢物可以通过降低胆固醇的作用来降低心血管疾病的风险；代谢产物主要是短链脂肪酸(SCFAd)和次级胆汁酸(BAs)。代谢物可能来源于候选NGP，如Akkermansia muciniphila、Bacteroides spp.、Clostridiumspp.、Christensenella minuta、Eubacterium spp.和Faecalibacterium prausnitzii。这些菌株在降低胆固醇方面对宿主有益的机制可能不同，包括通过代谢产物调节胆固醇吸收和代谢、抑制肝脏中的胆固醇合成、加速胆固醇消耗、将胆固醇转化为粪甾醇，以及直接掺入胆固醇等过程。在下一节中，我们将回顾微生物代谢产物和酶降低胆固醇水平的机制，以及执行这些作用的微生物。

2.1 SCFAs降低胆固醇水平的机制

SCFAs(主要是乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐)是结肠肠道微生物群产生的主要和重要的代谢产物。小肠中也检测到链球菌属物种和梭菌簇XIVa物种产生的乙酸盐和丁酸盐。在一项以高胆固醇饮食喂养的仓鼠的研究中，补充三种SCFAs可降低总胆固醇(TC)水平24%、18%和17%，表明SCFA是降低胆固醇水平的有效分子。F. prausnitzii、Eubacterium rectale、Eubacteriumhallii、Roseburia intestinalis和Ruminococcus bromii是人类肠道中负责丁酸生产的主要物种。其他细菌，如Butyricimonas、Coprococcus、Dysosmobacter和Subdoligranulum，也可以在人体肠道中产生丁酸盐。拟杆菌也是肠道中SCFA的重要产生菌，有研究表明拟杆菌的丰度与粪便中SCFAs水平呈正相关。丁酸梭菌(Clostridium butyricum)还可以产生大量丁酸盐，以及乙酸盐和丙酸盐。综上所述，这些报告揭示了多种肠道微生物产生SCFAs的能力，从而可能降低胆固醇水平。

SCFAs通过五种主要途径降低宿主体内的胆固醇水平(图1)。首先，SCFAs可以通过下调编码乙酰辅酶A合成胆固醇相关酶的基因来抑制胆固醇合成。通过该途径的胆固醇合成由转录因子固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)激活；该过程可分为四个步骤，需要肝脏和肠道内超过22种酶反应。人类肠细胞的基因表达分析表明，参与胆固醇生物合成的9个基因在丙酸盐和丁酸盐的作用下下调，包括合成过程中的速率决定酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)。基于动物的实验表明，摄入SCFA混合物可通过降低肝脏和小肠中的胆固醇合成速率来降低小鼠的血浆胆固醇水平。值得注意的是，乙酸盐已被证明可以下调仓鼠和大鼠Srebp2的表达并降低血清胆固醇水平。

SCFAs可以增强胆固醇向BAs的转化，从而降低胆固醇水平 。胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)是胆固醇转化为BAs的限速酶。基于动物的实验表明，向仓鼠施用SCFA混合物可增加肝脏中Cyp7a1的表达水平。SCFAs对Cyp7a1的上调导致胆固醇转化为BAs增加，以及从血液到肝脏的胆固醇摄入增加，而不改变胆固醇吸收，从而增加BAs的粪便排泄，并导致血浆胆固醇浓度降低。此外，向高脂饮食(HFD)喂养的小鼠施用丁酸可以增加Cyp7a1的表达，并防止动脉粥样硬化。

SCFAs可以通过调节胆固醇转运蛋白的表达来抑制肠道胆固醇同化 。在肠细胞中，十二指肠中大量表达的尼曼匹克C1样蛋白1(NPC1L1)介导胆固醇吸收，而ATP结合盒转运体G5和G8(ABCG5/8)可形成异二聚体，导致胆固醇外流。人肠细胞系Caco-2细胞与丁酸盐孵育可降低NPC1L1的表达，而细胞中ABCG5/8的mRNA水平升高。一项基于动物的实验表明，外源性丙酸盐降低了HFD喂养小鼠的Npc1l1表达，从而减轻动脉粥样硬化。在基线LDL胆固醇水平升高的受试者中，口服丙酸盐也降低了LDL胆固醇、TC和非HDL胆固醇水平。此外，丁酸降低了小鼠肠道组织中Npc1l1的表达，增加了Abcg5/8的表达，从而抑制了肠道胆固醇的吸收，预防动脉粥样硬化的发生。

此外，SCFA可通过调节ATP结合盒转运体A1(ABCA1)加速胆固醇的输出，从而影响巨噬细胞中的胆固醇水平，ABCA1将胆固醇从外周巨噬细胞和肝脏中转运出。在摄取过量的低密度脂蛋白后，巨噬细胞可以形成充满脂肪滴的泡沫细胞，并导致CVD。体内、体外和离体实验表明，丁酸促进Abca1的表达，增加巨噬细胞胆固醇的外排，从而防止HFD诱导的小鼠动脉粥样硬化。

SCFAs也被提出可以通过G蛋白偶联受体41和43(GPR41/43)介导的信号通路影响胆固醇水平。在脂肪细胞中，SCFA–GPR相互作用刺激瘦素的产生，瘦素是一种信号分子，通过抑制Srebp2和胆固醇生成基因的表达来减少肝脏脂肪生成和胆固醇合成，从而进一步降低胆固醇水平。向猪施用乙酸盐可降低TC并增加瘦素浓度，表明SCFAs可通过瘦素信号通路影响胆固醇代谢。

综上所述，SCFAs影响胆固醇代谢的五种机制表明，产生SCFA的细菌可以通过多种方式有益于宿主的健康。此外，SCFA产生活性可以用作发现和开发NGP的指南。

 (A)肠道微生物发酵纤维产生的SCFAs通过SREBP2调节降低胆固醇合成途径中的基因表达。(B) SCFAs还增加CYP7A1的表达，从而加速胆固醇向BAs的转化。(C) SCFA还通过上调ABCG5/8表达和下调NPC1L1表达介导肠细胞中胆固醇吸收。(D)在巨噬细胞中，SCFAs增加ABCA1的表达以增强胆固醇外排。(E) SCFAs还激活脂肪细胞中的GPR41以产生瘦素，从而进一步抑制SREBP2的表达。缩写：ABCG5/8，ATP结合盒转运蛋白G5和G8；BA，胆汁酸；CYP7A1，胆固醇7α-羟化酶；GPR41，G蛋白偶联受体41。NPC1L1，尼曼匹克C1样蛋白1；SREBP2，固醇调节元件结合蛋白2。

2.2 肠道微生物胆盐水解酶降低胆固醇水平的机制

胆固醇向BAs的转化约占胆固醇日输出量的90%，是胆固醇分解代谢中重要的过程。两种主要的BAs，胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CDCA)，是肝脏中BA合成途径产生的主要代谢产物。CA和CDCA与肝脏中的牛磺酸或甘氨酸结合，并释放到十二指肠中以促进脂质代谢。结合BAs在小肠和大肠中被微生物胆盐水解酶(BSH)进一步水解，生成氨基酸和初级BAs，从而启动肠道中的BA转化。BSHs可通过两种机制降低宿主体内的胆固醇水平：(i)在小肠中形成胶束，以及(ii)通过粪便增加BA排泄。在小肠中，BAs与胆固醇、脂肪酸和单甘油酯形成胶束。BSH产生的非结合BAs比结合BAs更疏水，更难溶解，这减少了它们被动流入肠细胞。因此，BSH活性的增加可能会减少膳食胆固醇的吸收，并增加BA通过粪便的排泄，从而产生降低胆固醇的作用。BA排泄增加可进一步减少肠道中BAs循环池的大小。这些BA可以通过增加胆固醇从头合成BA来替代，从而进一步降低宿主胆固醇水平。

BSH活性是益生菌筛选的关键标准。动物实验表明，这些物种的BSH可能对宿主健康产生反作用。例如，小鼠唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius，属于厚壁菌门)的BSH的高水平表达降低血浆胆固醇和宿主体重增加。相比之下，由产生BSH的Bacteroides thetaiotaomicron定殖的小鼠在HFD上的体重比由缺乏相关水解酶的细菌定殖的老鼠增加。唾液乳杆菌和B. thetaiotaomicron的BSH相互冲突的影响可能是由于菌株定殖的差异。唾液乳杆菌可能定殖于小肠以影响脂质代谢，而B.thetaiotaomicron更可能定殖在盲肠以影响BA池和相关信号。这些数据表明，来自厚壁菌门(如乳酸杆菌)的BSH编码益生菌是降低胆固醇水平的有希望的候选物。

在肝脏中，胆固醇可以转化为初级BAs。它们与牛磺酸或甘氨酸结合并运输到小肠，在小肠中结合的BAs被水解以产生初级BAs。初级BAs可以通过微生物催化反应进一步转化为次级BAs。在胆固醇向次级BAs的转化过程中，微生物BSH催化是关键步骤。增加肠道中BSH的丰度会加速BA的排泄，从而加速胆固醇转化为BAs的整个过程。缩写：CYP7A1，胆固醇7α-羟化酶。

2.3 次级BAs的降胆固醇功能

次级BAs由初级BAs通过大肠中微生物催化的脱羟基化、差向异构和/或脱氢反应形成(图3)。脱氧胆酸(DCA)和石胆酸(LCA)是主要的次级BAs，分别占人体粪便中BA成分的34±16%和26±10%。肠道BA的第三种丰富的成分由3β-羟基(iso)-BAs(27±18%)和熊去氧胆酸(UDCA，5.5±9.3%)组成。此外，iso-、oxo-、allo-、oxoallo-和isoallo-LCA在日本百岁老人的肠道中富集，表明BAs与人类健康和寿命密切相关。大而复杂的BA池通过其与各种受体的相互作用和激活与各种过程相关，其中受体主要是位于细胞膜中的法尼醇X受体(FXR)和武田G蛋白偶联受体(TGR5)。

FXR在肠、肝和肾中大量存在，其激活通过多种途径调节胆固醇代谢(图3)。动物实验表明，FXR的激活通过降低胆固醇的作用在很大程度上阻止了动脉粥样硬化的发展。介导FXR刺激的BAs的结合亲和力从强到弱排列如下：CDCA>DCA>LCA>CA。首先，FXR激活可以降低小鼠肝脏中的SREBP-2和HMGCR蛋白水平(图3A)。其次，FXR通过调节肠细胞中ABCG5/8的表达来调节胆固醇的流出和排泄(图3B)。在一项关于小鼠胆固醇排泄的研究中，使用FXR激动剂(PX20606)在肠道中激活FXR被证明可诱导Abcg5/8的上调，导致胆固醇外流到内腔，并排出约60%