小胶质细胞介导一种常见的与帕金森病关联的遗传变异

对多种神经退行性疾病的研究已经确定了多种与疾病风险相关的遗传变异。例如，帕金森病（PD）的发病风险部分归因于由全基因组关联研究（GWAS）所确定的富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）基因的编码突变和LRRK22基因座5'区的常见非编码突变。然而，GWAS变体及其致病的机制在很大程度上尚不清楚。来自美国国家卫生研究院的Mark R Cookson团队利用单细胞测序和CRISPR基因编辑等技术，发现LRRK2基因的单核苷酸多态性（SNP）rs6581593能影响小胶质细胞LRRK2表达，从细胞类型角度揭示了LRRK2介导PD风险的分子机制。

GWAS可以通过对比患病人员和正常人员之间的SNP推测基因组的哪些区域介导疾病的发生；通过结合其他测序数据集来确定介导疾病的候选基因和变体；随后通过基因表达的数量性状基因座（eQTL）识别疾病关联的基因突变。多项研究表明，SNP rs76904798与PD具有重要相关性，然而，这一相关性的机制仍不明确。近年来，细胞类型特异性的基因表达研究鉴定出了多个与PD发病相关的细胞类型，如多巴胺神经元、少突胶质细胞及少突胶质细胞前体细胞等。此外，LRRK2基因也在其他多个细胞类型表达，如兴奋性神经元、多棘神经元等。但哪一类细胞的LRRK2基因表达能介导PD风险目前不得而知。本篇文章的研究人员通过实验确定了特定脑细胞类型在LRRK2位点对疾病风险有贡献。他们在小胶质细胞中发现了LRRK2的eQTL，并在诱导多能干细胞（iPSC）衍生的小胶质细胞中重现实验结果。作者还指出控制基因型依赖性LRRK2表达的开放染色质的小胶质细胞特异性区域，并利用CRISPR技术确定远离GWAS信号的SNP为因果变异体。这些结果表明，通过研究SNP基因型与细胞类型依赖性基因表达之间的关系，可以促进GWAS基因座的解释。

首先，作者将人额叶皮质分离到的细胞核进行snRNA测序和snATAC测序分析。接着，作者取患者来源的外周血单核细胞（PBMC）诱导成多能干细胞（iPSC），再分化为小胶质细胞（iMicroglia），将iMicroglia进行RNA测序和ATAC测序，并对人小胶质细胞的测序结果与iMicroglia进行比较。作者通过溶酶体损伤干预和CRISPR基因编辑等处理，进行Western blot和定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）等进行分子机制研究。

1、人脑小胶质细胞rs76904798突变和LRRK2的表达相关

为了确定哪种脑细胞类型中存在LRRK2的eQTL，研究人员对来自北美脑表达联盟（NABEC；基因型和表型数据库）的15名供体的脑样本进行了单核RNA测序（snRNAseq），共捕捉到了近12万个单细胞核，鉴定了9类细胞的54个细胞亚群，发现LRRK2在少突胶质前体细胞（OPC.3）、兴奋性神经元（ExN.17）和小胶质细胞（MGL.13；）中高表达。接着，作者探究了PD风险突变体对不同细胞类型LRRK2表达的影响。结果发现，来自SNP rs76904798的TT基因型供体，其小胶质细胞的LRRK2表达高于CC基因型供体。在平均每个供体的每簇LRRK2表达后，作者将T等位基因的数量与LRRK2表达做相关性分析。发现LRRK2的表达和rs76904798-T等位基因仅在小胶质细胞中存在相关性，而在兴奋性神经元（ExN.17；）不存在相关性。

2、rs76904798突变增加LRRK2的表达和活性

研究人员体外分化iPSC来源的小胶质细胞（iMicroglia）进行单细胞核RNA测序，并将iMicroglia的测序数据与人额叶皮质单细胞核RNA测序数据整合，结果显示iMicroglia与人脑小胶质细胞基因表达存在高度相关性（Pearson R=0.74）。

接着，作者建立了12个不同病人来源的iMicroglia细胞系，其中6个为纯合保护性CC基因型（rs76904798 CC），6个为杂合保护性风险基因型CT型（rs76904798 CT），检测这些iMicroglia的 Ser935和Rab10的磷酸化用于评估LRRK2活性。结果发现CT型的iMicroglia中Ser935和Rab10的磷酸化升高，用LLOMe损伤溶酶体后增强了这种效应。CT型的iMicroglia其LRRK2 mRNA和蛋白表达均较CC基因型高。这些实验证明iMicroglia的激活受到PD风险基因型的调控。

3、人额叶皮质和黑质中的LRRK2基因转录起始位点在小胶质细胞内具有高的可及性

为了研究LRRK2基因表达受遗传变异的调控机制，研究人员又对12个人额叶皮质样品（4个供体）进行ATAC测序（染色质可及性测序），捕捉了4万个单细胞核，并鉴定出22个细胞类型。对每个细胞类型在LRRK2基因附近的染色质可及性进行研究，发现LRRK2的转录起始位点（TSS）在小胶质细胞内具有高的可及性，并且小胶质细胞中的LRRK2基因可及性与小胶质细胞rs76904798位点T等位基因具有正相关，这一结果提示，rs76904798位点伴随的PD风险与小胶质细胞内LRRK2基因可及性的增加相关。研究人员在黑质也发现了这一现象。

4、iMicroglia的LRRK2区域染色质结构类似于的脑小胶质细胞

为了明确iMicroglia如何再现脑小胶质细胞的染色质可达性，研究人员对iMicroglia也进行了ATAC测序，并与iPSC衍生的前脑神经元（iFbN）进行比较。结果显示，iMicroglia与脑小胶质细胞聚集，iFbN与脑抑制性神经元群聚集。提示，iMicroglia和脑小胶质细胞的全基因组染色质可及性相似。，脑小胶质细胞LRRK2区域的染色质可及性峰值在iMicroglia中发现，但在iFbN中未发现。这些实验结果表明，iMicroglia的LRRK2区域染色质结构类似于脑小胶质细胞。

5、单个候选PD风险SNP不会改变iMicroglia中的LRRK2表达

随后，研究人员使用CRISPR-Cas基因编辑技术，进行定向单核苷酸置换以产生rs76904798 TT型和rs1491942 GG型（位于LRRK2的转录起始位点），并在iPSC细胞系里引入这两种PD风险变异体，结果发现此前GWAS发现的主要变异体rs76904798和位于LRRK2的转录起始位点rs1491942并不影响iMicroglia  LRRK2基因的转录和表达。

6、含rs6581593的顺式调节元件调节小胶质细胞LRRK2表达

在前面结果的基础上，研究人员设计了CRISPRi筛选体系来研究LRRK2基因的上游功能元件。他们向表达dCas9-KRAB的iMicroglia转导了一个慢病毒包装的单向导RNA（sgRNA）文库，包括480个跨越靶峰的单向导RNA、3个候选功能性SNP（rs7294619）的单向导RNA以及50个非靶向的对照单向导RNA。转导的细胞用细胞复用寡核苷酸（CMOs）标记，并进行scRNAseq，允许分别捕获每个细胞的转录组、sgRNA序列和CMO标记序列。作者研究了跨每个靶峰区域的Cas9-KRAB介导的抑制作用。与sgNT相比，仅抑制LRRK2 TSS 38441号峰和LRRK2 TSS上游约15kb处的38437号峰这两个峰区导致LRRK2表达降低。作者研究了单个sgRNA位点上dCas9-KRAB介导的抑制对LRRK2表达的影响。结果发现靶向rs6581593附近的38437号峰的sgRNA导致LRRK2表达降低。这些结果表明，包含rs6581593的38437峰下区域是调节小胶质细胞LRRK2表达的增强子元件。