儿童克罗恩病的成功饮食治疗与细菌生态失调和炎症代谢型向健康对照的转变有关

克罗恩病排除饮食+部分肠内营养(CDED+PEN)或完全肠内营养(EEN)的治疗可缓解轻度至中度儿童克罗恩病(CD)并减少炎症反应。本研究旨在评估营养治疗是否可以通过调节菌群组成和功能失调从而得到缓解。评估了54例营养治疗(CDED+PEN或EEN)后儿童CD患者得到缓解的粪便宏基因组序列、短链脂肪酸(SCFA)和胆汁酸(BA)，并与26例健康儿童进行了比较。饮食疗法降低CD患儿变形菌门的相对丰度，增加了厚壁菌门的丰度。CD患儿有M1和M2两种代谢型，而健康儿童仅有M1代谢型。M1的特征为拟杆菌门和厚壁菌门丰度增加、变形菌门丰度减少、短链脂肪酸合成途径增加，而M2的特征为变形菌门丰度增加、SCFA降解相关基因富集。M1占比在饮食治疗期间增加：46%、63%和74%(分别在第0周、6周、12周)。12周后，变形菌门的菌属(除E. coli外)恢复至健康对照水平。尽管SCFA合成途径增加，但症状缓解效果与SCFAs增加无关。初级BA在CDED+PEN组没有变化，但在EEN组降低。综上所述，饮食疗法成功地调节了菌群组成和功能失调。然而，12周的饮食不足以完全恢复失调。我们的数据表明菌群组成和代谢型很重要，并在饮食干预的早期临床反应中迅速变化。因此，纠正生态失调可能是未来CD治疗的重要目标。  

结果

从74名患者中的54名患者获得了完整的宏基因组序列(临床缓解)，41名参与者在三个时间点均得到可用数据(CDED+PEN：n=23，EEN：n=18)。由于样本可用性，我们分析了53例患者(151个样本)的SCFA数据和42例患者(93个样本)的BAs数据。两组在年龄、性别、疾病部位、病程、疾病活动度、C-反应蛋白(CRP)或药物使用方面的基线特征无统计学差异。

1 微生物组随着饮食引起的缓解而改变

1.1 0-6周:变形菌减少

根据宏基因组的分类学数据，基于Bray-Curtis距离的差异性检验显示，在基线和第12周之间两种饮食方式使得患者菌群组成向健康组转变(Permanova p=0.001)。通过LEfSe分析更详细地识别了这些菌群变化，确定了处理组和健康对照组之间的差异菌群。与健康组相比，基线期CD患儿肠道中变形菌门

总体而言，从第0周到第6周，两种饮食疗法都减少了变形菌门丰度，增加了厚壁菌门丰度。尽管在第6周通过饮食治疗达到临床缓解时变形菌门的丰度下降，但与健康对照组相比仍有所增加。与健康对照相比，基线期患者肠道中E. coli相对丰度尤其引人注目(Wilcoxon BH校正，p=0.0005)。

由于分析是基于成分数据，对其它类群增加和/或减少可能比较敏感，我们通过对数比来检验与协变量相关的差异丰度，并通过Qurro进行可视化。以Bacteroidetes作为参考组，因为它在样本和时间点之间一致。第6周时，CDED+PEN饮食患儿肠道中厚壁菌门总体上没有增加(p>0.05)。然而，变形菌门丰度在前6周内下降(p=0.02)，主要由γ-变形菌(0周vs 6周，p=0.073)驱动，即来自Escherichia属。有趣的是，在前6周，EEN饮食患儿肠道中厚壁菌门和变形菌门的丰度变化并不明显(p>0.05)。在门水平上的ALDEx2成分分析发现，在第0周和第6周，变形菌门丰度在两种饮食疗法与健康对照组之

1.2 第6-12周:变形菌进一步减少

在第6周和第12周之间继续使用CDED+PEN饮食治疗使得变形菌门丰度进一步减少，并接近健康对照组。然而，在CD患者肠道中Proteobacteria属Escherichia和Sutterella含量仍然比较丰富，并与健康样本存在差异(Wilcoxon p<0.05，LDA>2)。值得注意的是，与其它Proteobacteria属相比，炎症状态下基线期Escherichia的相对丰度要高得多。在增加的厚壁菌门中，患者肠道中Faecalibacterium和Blautia含量增加，但仍与健康对照组有差异。在第12周时，与CDED+PEN饮食相比，健康组样本中的Anaerostipes、Ruminococcus、bacilli、Porphyromonadaceae、Bifidobacteriales、Ascomycota和Caudovirales的丰度更高。

在EEN饮食后的第6周和第12周之间逐渐恢复正常饮食导致变形菌门(即Enterobacter)丰度增加，并与健康对照组有明显差异。厚壁菌门中的Streptococcus、Blautia和Faecalibacterium的丰度随着恢复正常饮食而增加，而Peptostreptococacceae、Eubacterium、Anaerostipes、Coprococcus和Ruminococcus仍然在健康对照组中比较丰富。

对CDED+PEN组样本进行Songbird成分分析，再次发现除Oscillospiraceae外(0周vs 12周，p=0.03)，厚壁菌门丰度没有发生变化(6周 vs 12周，0周 vs 12周)，在门水平上，变形菌门丰度在第6周和第12周时持续减少，并与基线相比下降(6周 vs 12周，p=0.16；0周 vs 12周，p<0.01)。这一结果主要由Escherichia-γ变形菌丰度下降导致(p<0.01)。在该分析的所有时间点，EEN饮食引起菌群丰度变化均不( p>0.05)。门水平的ALDEx2分析发现，EEN样本中变形菌丰度在第12周时与健康对照组相比存在差异。然而，第12周时CDED+PEN样本与健康对照组间没有差异。

2 微生物组代谢型

为了超越单独的酶/代谢物的关联研究，我们使用无监督贝叶斯群落代谢分析方法(BiomeNet)来确定与健康、疾病和实现缓解相关的微生物代谢型。在无监督分析中，将健康对照组与所有CD患者进行比较，发现患者样本分为两种代谢类型(M1和M2)。所有健康对照组均以后验概率(PP)>0.9归类于代谢型M1。CD患者同时具有M1和M2两种代谢型，其混合类型与治疗阶段有关。随着饮食治疗进行，得到临床缓解CD患者的M1比例不断增加，从治疗前的48%增加到第6周的63%和第12周的74%，并且混合权重的变化是的[配对Wilcoxon检验；基线 vs 第6周(p=0.03)；基线vs第12周(p<0.01)；第6周 vs 第12周(p<0.01)]。

19个主要的反应亚网络对M1和M2有不同的影响。在代谢型确定的通路中，有1个反应子网络在两种代谢型之间存在差异，涉及多种糖代谢的反应，特别是被磷酸转移酶修饰的反应。

利用16S rRNA基因数据中鉴定的分类群，对M1代谢型样本通过BioMiCo分析鉴定的群落结构进行Cytoscape可视化。节点代表分析中识别的优势分类群，其大小表示这些分类群在组合中的贡献的总后验概率。边表示在一个组合中同时出现的分类群。

利用16S rRNA基因数据中识别的分类群，对M2代谢型样本通过BioMiCo分析鉴定的群落结构进行Cytoscape可视化。节点代表分析中识别的优势分类群，其大小表示这些分类群在组合中的贡献的总后验概率。边表示在一个组合中同时出现的分类群。

3 短链脂肪酸

在第0周时，CDED+PEN和EEN组之间的SCFAs没有差异。粪便SCFA浓度在CDED+PEN组的三个时间点没有变化(p>0.05)。与基线相比，EEN饮食达到缓解的患者肠道中总SCFA浓度以及乙酸、丙酸和丁酸含量在第6周下降(Welch's t检验分别为p<0.01，p<0.01，p=0.02，p<0.01)，摄入其他食物后，在第6周和第12周相比其含量增加(分别为p=0.01，p=0.02，p=0.11，p<0.01)。在第6周得到缓解的CDED+PEN组和EEN组的总SCFA、乙酸、丙酸和丁酸存在差异(p<0.01，p<0.01，p=0.02，p<0.01)，但这些差异在第12周时消失。

SCFA浓度也与患者的M1、M2代谢型相关。M1与较高浓度的丁酸(p=0.02)和戊酸(p<0.001)相关。参与丁酸合成的基因也与M1和M2相关。以90% PP为临界值发现，M1中增加的基因包括丁酸激酶(K009290)、磷酸丁酰转移酶(K00634)、4-羟基丁酰基-CoA脱水酶(K14534)和β-赖氨酸5,6-氨基变位酶(K01844)减少的基因包括L-谷氨酸降解为丁酸和烯酰基-CoA水合酶的基因