心脏瓣膜的正常形态形成需要由心内膜细胞分化的巨噬细胞

胎生期小鼠心内膜细胞通过Nkx2-5及其下游工作的两个信号因子分化为巨噬细胞的转录调控机制，确定其巨噬细胞是心脏瓣膜正常形态形成的必需存在。

胎生期心脏在短时间内发生较大的形态变化。具有多分化能力的心脏前体细胞通过一些重要的转录因子的作用分化成构成心脏的细胞。转录因子Nkx2-5具有将构成心脏内膜的心内膜细胞的一部分分化为血细胞前体细胞的作用。

本次研究旨在通过探索在Nkx2-5下游工作的信号因子，阐明更详细的分子调控机制，并进行了研究。利用生物信息学分析技术的一细胞RNA序列，从Nkx2-5缺失小鼠胎仔的心脏中寻找在Nkx2-5下游工作的信号因子。还研究了这些信号路径的作用。

Nkx2-5下游工作的Notch信号，与心脏前体细胞的命运决定相关

用单细胞RNA序列数据比较野生型和Nkx2-5缺失小鼠胎仔心脏（胎生第9.5天胚胎）的基因表达。以基因表达方式为基础对细胞种类进行分类，发现心内膜细胞有5种，其中2种心内膜细胞在Nkx2-5缺损小鼠中消失。这两种细胞是构成以后的心脏瓣膜或中隔的心内膜床的细胞和来自心内膜细胞的血细胞前体细胞。因此，Nkx2-5意味着心内膜细胞是分化为心内膜床细胞和血细胞前体细胞所必需的转录因子。

接着，为了调查心内膜细胞中什么样的信号途径受到Nkx2-5的转录控制，对野生型和Nkx2-5缺损小鼠的心内膜细胞整体的基因表达差进行生物信息学分析。结果，在Nkx2-5缺失的小鼠中，对细胞命运决定重要的Notch信号明显减少。制备和分析基因重组小鼠表明，由于心脏充满血液，因此在Nkx2-5下游激活Notch信号会导致心脏产生过量的血液。这次，在Nkx2-5缺损的状态下，分析强制表达Notch信号时表型是否恢复正常（救援实验）。结果，观察到Nkx2-5缺失的小鼠心脏表型心内膜床细胞和血细胞前体细胞的缺失通过Notch信号的强制表达而被拯救。综上所述，证明了Notch信号在Nkx2-5下游工作，促进了心脏的心内膜床形成和造血。

对维甲酸信号抑制·Notch信号促进、血细胞前体细胞分化和巨噬细胞成熟很重要

使用上述单细胞RNA序列数据的另一生物信息学（NicheNet）分析预测抑制活性型维甲酸（all-trans Retinoic Acid：atRA）产生的代谢酶Dhr3是对造血性心内膜细胞分化有影响的靶基因。Dhrs3的表达在Nkx2-5缺损的小鼠心内膜细胞中明显减少，认为在血球前体细胞的分化中需要抑制维甲酸信号。

因此，为了调查维甲酸在造血细胞分化中的作用，实施了从胎生期的心脏及其他造血器官（卵黄囊与胎盘相连的背侧大动脉部位）体外诱导造血细胞分化的实验。分析了atRA（活性型维甲酸）、维甲酸抑制剂（DEAB）和Notch信号抑制剂（DAPT）的效果。结果表明，当来自心脏的血细胞前体细胞成熟为巨噬细胞时，需要抑制维甲酸和Notch信号的活性。

另外，分析在Nkx2-5下游强制表达Notch信号并诱导心内膜细胞造血的心脏。结果证实，巨噬细胞产生增加和Dhrs3阳性巨噬细胞比例增加。综上所述，我们证明抑制维甲酸信号和促进Notch信号对血细胞前体细胞分化和巨噬细胞成熟都是重要的。

Nkx2-5下游两条信号通路，有助于心脏的形态形成

分析通过基因重组使这些细胞缺损的小鼠心脏的表型。其结果，在变异小鼠身上发现了心脏瓣膜中胶原等细胞外基质的蓄积，表明来自心脏的巨噬细胞在心脏瓣膜的形态形成中具有必要的作用。

这些结果证明，Notch信号和维甲酸信号有助于从Nkx2-5依赖的心内膜细胞造血和巨噬细胞分化，有助于由心内膜床部分形成的心脏瓣膜的组织重构。

期待着先天性心脏病的病情阐明等

他说，此次研究证明了通过心脏形成的血球系祖细胞形成巨噬细胞的分子机制，这意味着这是一种进化保存的生命现象。巨噬细胞容易被认为是免疫细胞，但在发生期反而与形态形成密切相关。研究小组表示，今后通过进行验证，可以加深对巨噬细胞在心脏中的作用的理解，期待将来能够阐明先天性心脏疾病的病情。