纳米抗体如何实现如此高的特异性？

免疫系统的强大功能在很大程度上取决于抗原的多样性，这种多样性促使B淋巴细胞产生特异性的、紧密结合的抗原受体（BCR）。生物学研究的重要工具——传统抗体（Abs）以其精湛的结合特异性和对靶抗原的高亲和力，成为了生物制药行业的基础。然而，这些抗体的结合特异性的巨大多样性是由重链（VH）和轻链（VL）两个可变域中的序列变异产生的，如此一来，仅仅这些序列的排列组合就可能在人类中产生至少10种可能的BCR，其数量远超个体B淋巴细胞群体的规模。这个巨大的潜在序列多样性是如何转化为抗原特异性的呢？这个问题目前尚未完全明朗。显然，存在一定的冗余——并非每个的VH-VL组合都会产生独特的结合特异性。然而，想要知道改变结合特异性所需的氨基酸突变数量及其位置，目前我们还无法准确预测。

在骆驼、美洲驼和羊驼等骆驼科物种中，科学家们发现了一类特殊的重链抗体，它们可能为我们提供了一个更易于研究的系统，因为这些抗体中完全没有轻链的存在。其中，被称为纳米抗体的可变VHH结构域（约为传统抗体的1/10大小），展现出了相当高的稳定性，并且能够结合酶活性位点，病毒衣壳以及G蛋白偶联受体中难以接近的表位。骆驼的VHH结构域与Ab的VH结构域在功能上同源，都包含三个高度可变的环H1、H2和H3。这三个环在折叠蛋白结构域的一侧形成了扩展的结构界面，为抗原结合界面或旁位提供了空间，从而决定了Nb的抗原结合特异性。相较于六个在抗体 VH-VL结构域复合物中高度可变的环，这三个环的潜在序列多样性明显更小，这也使得骆驼的VHH结构域在与抗原结合时的特异性更易于掌握和控制。

对于纳米抗体（nanobody，Nb）和传统抗体（Abs）来说，大的挑战在于解析出将氨基酸序列（特别是副位残基的挑选）与折叠分子的结合特异性相关联的分子密码。在常规的抗体中，副位通常会出现在VH和VL结构域的结合处，通常会涉及到多达六个不同的高变环区域的残基。此外，VH和VL结构域的结合方式也有很大的灵活性，使得抗体能够尽可能地增加潜在抗原结合表位的多样性。相比之下，纳米抗体（nanobody，Nb）的副位则完全包裹在VHH结构域内部，这样便大大限制了潜在抗原结合表位的空间多样性，而不过多地影响其结合特异性的多样性。实际上，纳米抗体（nanobody，Nb）通常会与其靶抗原紧密结合，其亲和力也与典型单克隆抗体相仿。尽管纳米抗体（nanobody，Nb）体积小巧且结构单一，但是它们是如何实现如此多样化的结合特异性的呢？

为了解决这个问题，研究人员建立了两个共晶蛋白复合物结构的数据集，每个数据集都包含纳米抗体（nanobody，Nb）抗原或传统抗体（Ab）抗原蛋白复合物。数据集由90个非冗余蛋白质结合纳米抗体（nanobody，Nb）组成，PDB中具有纳米抗体（nanobody，Nb）抗原共晶体结构。

为了量化纳米抗体（nanobody，Nb）VHH结构域和传统抗体（Ab） VH结构域不同部分的结构变异性，研究人员对抗原接触残基的结构比对与鉴定；确定了纳米抗体（nanobody，Nb）抗原和传统抗体（Ab）抗原复合物的90种共晶体结构，分析了抗原结合构象中的纳米抗体（nanobody，Nb）和传统抗体（Ab）结构变化。

通过对纳米序列的研究分析发现，米抗体（nanobody，Nb）在其框架区域的序列和结构上更加保守，这表明米抗体（nanobody，Nb）没有很大程度地利用框架来增加可以编码的结合特异性的数量。那么，为何纳米抗体（nanobody，Nb）的序列长度缩短且单域结构紧凑，但依然产生如此多样化的结合特异性呢？

传统抗体结构中六个超变量环是确定Ab相互作用特异性的关键；相比之下，纳米抗体（nanobody，Nb）只有三个高变环，减少了可能的序列变异的空间，从而减少了潜在的相互作用特异性。因此，研究人员提出了三种潜在机制。

第一种机制与纳米抗体（nanobody，Nb） H1和H2环所表现出的增加的结构多样性有关。这些环并不比传统抗体（Ab）环表现出更大的序列变异，但结构分析表明，它们确实表现出更大的结构变异。与传统抗体（Ab）相比，这种结构多样性可能是由于不同的环序列特征——例如，较少的纳米抗体（nanobody，Nb）H1环含有稳定的F29，而纳米抗体（nanobody，Nb） H2环使用更大比例的小残基，这增加了结构的灵活性。无论纳米抗体（nanobody，Nb）如何取样更多种类的环主链构象，事实是它们对实现高特异性抗原结合的能力做出了重要贡献。

其次，根据研究数据显示，纳米抗体（nanobody，Nb）编码的每个氨基酸残基的序列多样性比传统抗体（Ab） H3环多7%左右。更长的H3环被认为能够使Nbs通过延伸到表位腔内的手指状突起与抗原结合。这些发现表明，纳米抗体（nanobody，Nb）利用其H3环中增加的多样性，使它们能够产生与它们受到挑战的抗原紧密特异性结合的能力。

研究人员基于共晶结构数据提出第三种机制，从比VH结构域更大的范围内绘制旁位残基的能力将促进抗原结合界面的形状和物理性质的多样性，使纳米抗体（nanobody，Nb）能够使用更广泛的表面，通过不同的结合模式与同源抗原相互作用。

总之，纳米抗体（nanobody，Nb）似乎并没有通过增加框架中的序列或结构多样性来产生特异性的多样性。这表明在小蛋白区域的分子特异性能力比我们基于经典抗体的预期要高得多，这表明使用相对受限的短氨基酸序列与多种靶标产生高亲和力特异性结合的潜力令人兴奋。