oxBS揭示膀胱癌的DNA甲基化鉴定预测PD-L1表达标记物

研究摘要：

背景：膀胱癌（Urinary bladder cancer，UBC）是泌尿系常见的恶性肿瘤之一，但其高复发率和对免疫治疗的响应机制仍不清楚，导致临床结果预测困难。表观遗传学变化（尤其是DNA甲基化）在膀胱癌进展中起着重要作用，且越来越多地作为诊断或预后预测的生物标志物进行研究。然而，由于此前传统的亚硫酸盐测序方法（RRBS）不能区分5mC和5hmC信号，导致关于羟甲基化知之甚少。

方法：本研究使用多组学方法来绘制了原发性和复发性膀胱癌的基因组、转录组、DNA甲基化组和羟甲基化组图谱。

结果：本研究通过全外显子组测序鉴定出参与UBC进展的的基因突变（如FGFR3、KDMTA和KDMT2C），然而这些基因突变中与UBC复发或PD-L1下调几乎不相关。整合RRBS和oxRRBS-seq数据，鉴定出在复发性膀胱癌中富集5hmC相关转录变化的脂肪酸氧化相关基因。在PD-L1高表达的膀胱癌样本中发现NFATC1（一种高度参与T细胞免疫应答的基因）基因体中存在5mC低甲基化DMR。由于全基因组中的5mC和5hmC变化呈负相关，因此仅基于RRBS数据结合了5mC和5hmC信号，减弱了癌症相关信号标记，不适合用作临床生物标志物。

结论：通过UBC样本的多组学分析，结果表明表观遗传变化比基因突变更多参与UBC复发和PD-L1调节，证明了使用DNA甲基化标记物预测膀胱癌患者免疫治疗反应的潜力。研究还表明仅仅采用RRBS方法联合检测5mC和5hmC水平会降低表观遗传生物标志物的预测准确性，揭示了使用oxRRBS-seq进行甲基化标记发现的优势。

项目设计：

（1）样本选取：

选取行腹腔镜膀胱（LRC）、膀胱部分切除术（PC）或经尿道膀胱肿瘤切除术（TURBT）的膀胱癌患者组织样本，采集膀胱肿瘤组织和癌旁组织。手术后立即用无菌生理盐水清洁组织，并储存在-80°C以进行检测。共采集45例患者膀胱组织标本45份，其中膀胱癌组织45份，癌旁组织18份。

总结：

本研究采用改进的全基因组DNA甲基化和DNA羟甲基化图谱绘制方法，将氧化还原代表性亚硫酸盐测序（oxRRBS）与传统RRBS相结合。oxRRBS可以实现5hmC至fC的选择性氧化。羟甲基化水平可以通过从RRBS中减去从oxRRBS获得的亚硫酸盐测序信号来确定。因此，可以使用RRBS+oxRRBS分别计算精确的5mC和5hmC水平，从而以更高的分辨率提供更详细的表观遗传学信息，更适合用作膀胱癌诊断和预后的生物标志物。