肿瘤免疫治疗：pMHC限制性抗体(TCRm)的获得策略

类似于T细胞受体(TCR)的方式识别MHC呈递肿瘤抗原的单克隆抗体(mAbs)，在肿瘤免疫治疗方面具有巨大的潜力。然而，由于抗体没有进化出αβ-TCRs结构上细微差别的p-MHC限制，分离TCRm抗体是费力的。这里提出了一种策略，通过重新设计预选的抗体，以与传统的αβ-TCRs结构相似的方式与p-MHC结合，快速分离高度多肽特异和MHC限制性的抗体。创建了以TCRm抗体CDR环的肽相互作用残基为重点的结构文库，并快速生成针对小鼠和人类肿瘤抗原的MHC限制性抗体，当形成IgG、双特异性T细胞结合蛋白(BiTE)和CAR-T时，这些抗体可以特异性地杀伤靶细胞。对选定的pMHC限制性抗体的晶体分析显示了高度的多肽特异性识别，验证了工程策略。这种方法可以在几周内产生肿瘤抗原特异性抗体，有可能实现快速临床转化。

单抗(mAbs)是一种有效的治疗药物，因为它具有高亲和力和靶标特异性，并且具有类药物的特性。针对MHC蛋白提呈的多肽肿瘤抗原的单抗，称为TCR-Mimic(TCRm)抗体，是一种新兴的免疫治疗手段，能够识别肿瘤细胞表面低水平表达的多种肿瘤抗原。这种TCRm单抗可以以多种形式用来实现不同的靶向杀伤，包括用于ADC和/或ADCC(抗体依赖性细胞毒性)的IgG、BiTEs和CAR-T的背景下。然而，抗体和αβ-TCR在识别其靶标的方式上进化了根本的结构差异，这限制了当前的TCRm技术。抗体利用CDR3的多样性和体细胞超突变，通过所有6个CDR环实现对蛋白质靶标表面的高亲和力。相比之下，由于pMHC表面的复合性质，αβ-TCR使用一种更细微的、MHC受限的识别方案。TCR主要使用胚系来源的CDR1和CDR2以极低的亲和力与MHC螺旋结合，而CDR3环的聚焦遗传多样性在很大程度上与MHC沟中结合的多肽抗原的‘up-facing’氨基酸残基结合。MHC螺旋识别和多肽专一性之间的这种微妙的能量平衡使TCR能够在称为扫描的过程中精细地区分不同的自体和异源多肽。抗体结合位点没有进化为pMHC表面的抗原特异性识别。分离与pMHC表面高亲和力和完全多肽选择性结合的MHC限制性抗体是一项困难的技术挑战，既耗时又得率低。

目前可用于分离TCRm抗体的技术不能解释抗体和TCR介导的抗原识别之间的结构能量差异。TCRm抗体一般通过常规方法分离，如小鼠杂交瘤和噬菌体展示文库技术。在每种情况下，都必须对每个pMHC靶标进行从头筛选。由于Abs与pMHC上的任何表位结合，与TCR不同，Abs不会自然偏向于与复合肽和MHC表面结合，这只占可结合的总pMHC表面的一小部分，因此命中率很低。然而，这些方法已经成功地鉴定了多肽特异性的TCRm抗体。然而，脱靶MHC反应的前景仍然取决于TCRm对接模式是否偏离平衡并且显示MHC螺旋接触的优势。TCRm抗体的这种pMHC结合模式可以与MHC螺旋具有相当大的结合能，从而使它们易于与健康组织上的自身pMHC发生不必要的反应。

分离TCRm抗体的另一种方法是专注于已知的以“常规的”TCR-like方式与pMHC结合的抗体。在这里，标准将是结合到pMHC类似于已知的典型的对角线‘足迹’中看到的大多数α-β TCR与MHC的复合体。这种足迹的特点在于，来自Vα和Vβ的种系编码的TCR CDR1和CDR2通常与MHC螺旋接触，以建立MHC特异性，而CDR3环询问MHC沟的中心是否有结合肽，尽管这有很大的差异。这一总体结构框架为TCRm抗体提供了一种理想的识别模式，但在实践中，通过前面提到的从头筛选方法很难识别它们。例如，即使已经被建立为肽特异性的TCRm抗体也可以表现出替代的、不希望看到的结合模式，主要是与MHC螺旋接触，显示出非TCR-like足迹。然而，存在以与TCRs几乎相同的结合模式与pMHC结合的TCRm抗体的结构例子，这可以被TCRm重新利用。

这里提出了一种快速、集中分离MHC限制性TCRm抗体的策略，方法是使用现有的与pMHC以TCR-like结合的TCRm抗体作为起始工程模板，然后，通过将文库专门集中在与肽接触的TCRm抗体CDR残基上，同时保留MHC接触，可以选择基本上受MHC限制的TCRm抗体文库。然后，这些文库可以在几周内针对同一MHC等位基因呈递的不同肽进行快速重新选择。这里介绍了这些文库的开发，针对一系列小鼠和人类肿瘤抗原的pMHC特异性的重新设计，以及这些TCRm抗体随后通过ADCC以TCRm-BiTE和CAR-T形式杀死肿瘤细胞的能力。给出了一种重新设计的人TCRm抗体的结构验证，由于这种选择策略，它表现出了对MHC选择性的增强。通过从偏向MHC的模板开始，这项技术足够快速，能够对个体患者的新抗原进行实时临床应用。

小鼠TCRm scFv文库的设计与构建

研究TCRm抗体与小鼠p-MHC分子的现有晶体结构，并鉴定了一种TCRm抗体25-D1.16(PDB:3CVH)，它以TCR-like的对接模式与OVA/H2-Kb结合，从而显示出理想的识别性能。该抗体与传统的TCR/pMHC对接足迹显示非常一致，其中CDR3主要(但不完全)集中在多肽上，而CDR1和2则集中在MHC螺旋上。选择25-D1.16作为scFv酵母展示文库的起始模板。在文库创建之前，在酵母表面展示了25-D1.16 scFv，以验证与OVA/H2-Kb tetramer的结合。25-D1.16 scFv显示酵母可被呈现OVA(SIINFEKL)肽的H2-Kb tetramer特异性染色，表明scFv已正确折叠，是构建文库的良好起点。

在文库设计中，只随机化了25-D1.16 Ab CDR环上与OVA肽接触的氨基酸位置，而不修改与MHC接触的残基。这里是逻辑是，如果随后选择该文库针对除OVA以外的H2-Kb提呈肽，并且抗体的MHC结合残基完整，则该文库将被赋予一定程度的H2-Kb偏向。目标是允许对接转移以适应新的多肽相互作用，但仍然受到MHC的限制。通过对25-D1.16-OVA/H2-Kb结构的分析，在H2-Kb呈递的 OVA多肽的4Å（Å是晶体学、原子物理、超显微结构等常用的长度单位，1Å=10^-10m，nm的1/10）内鉴定了9个抗体残基。然后，通过在这9个残基中引入简并的三聚体密码子突变，建立了一个多样性约为5×10^8的文库。

小鼠TCRm抗体的筛选及结合特性研究

作为一个新的靶点，选择了一个表征良好的小鼠肿瘤抗原Trp2 (SVYDFFVWL) (180-188)，它是由H2-Kb呈递的小鼠B16黑色素瘤表达的。对偏向TCRm scFv文库进行了酵母展示选择，以Trp2/H2-Kb tetramer染色。经过四轮Trp2/H2-Kb选择和一轮OVA/H2-Kb负选择后，scFv文库对Trp2/H2-Kb特异地富集，但对OVA/H2-Kb没有。第四轮scFv文库筛选进一步用Trp/H2-Kb tetramer进行FACS分选，以富集高亲和力结合蛋白。选择了4个识别Trp2/H2-Kb的克隆进行进一步分析。由于克隆 13对Trp2/H2-Kb复合体表现出高的亲和力，因此选择它进行进一步分析。对Trp2多肽进行了丙氨酸扫描，结果显示TCRm Ab对中心位置的P5和P6残基具有高度特异性，证实了文库设计保留了亲本TCRm Ab的多肽位置选择性。克隆 13，当被变为scFv和IgG重组蛋白时，能够以肽剂量依赖的方式与Trp2肽脉冲的H2-Kb+EL4细胞特异性结合，检测到少的本底结合。

Trp2/H2-Kb TCRm抗体的功能鉴定

目前还没有关于小鼠肿瘤抗原的TCRm的报道，这提供了探索治疗方式的机会，并将克隆13 TCRm抗体作为成像工具尝试量化该肿瘤抗原在B16F10细胞上的表达水平。鉴于需要仔细定量，使用B16F10靶细胞和表达活化T细胞核因子(NFAT)报告基因的mFcγRIV的小鼠效应细胞来替代ADCC，以大限度地减少原代细胞ADCC检测的变异性。为了大限度地提高TCRm抗体的ADCC报告基因活性，生成具有工程化Fc的小鼠IgG2a变体：野生型mIgG2a、带有L234A/L235A/P329G(LALAPG)突变的mIgG2a、以及带有S239D/I332E(DE)突变的mIgG2a，都已知能增强ADCC。虽然所有的IgG都显示出同等的结合活性，但只有DE变体对IFN-γ处理的Trp2多肽脉冲的B16F10细胞显示出ADCC报告活性，并且ADCC报告活性与mIgG2a(DE)浓度密切相关，半数大有效浓度约为15ng/ml。

在没有IFN-γ和多肽脉冲的情况下，B16F10上缺乏强大的ADCC报告活性，这突显了像许多肿瘤抗原一样，内源性表达的Trp2的低表达水平。针对Trp2/H2-Kb的高亲和力TCRm的获得能够使用全内反射荧光(TIRF)显微镜来检测B16F10细胞表面Trp2抗原的表达水平。试图在单分子水平上量化佳ADCC所需的Trp2/H2-Kb细胞表面表达水平。为此，设计了一种带有ALFA标签的mIgG2a13 (mIgG2a13-ALFA)，使其能够用抗ALFA标记的NBs原位标记细胞表面，它与ALFA与皮摩尔亲和力结合。根据IFN-γ和/或Trp2肽的处理，观察到单个mIgG2a13-ALFA与细胞表面Trp2/H2-Kb结合，它们随机扩散到质膜中。经IFN-γ和Trp2多肽处理后，mIgG2a13-ALFA的细胞表面密度由未处理细胞的＜0.05μm-2增加到约0.8 μm-2。用相同浓度的Trp2多肽进行了剂量反应实验，以滴定每个B16F10细胞表达的Trp2/H2-Kb分子的数量和可测量的ADCC报告活性。观察到，在加入Trp2后，B16F10细胞上Trp2密度随剂量的增加而增加，这与ADCC报告基因的剂量反应密切相关。估计在+peptide/+IFN-γ条件下，ADCC所需的每个细胞小Trp2分子数量约为1000-2000 Trp2。在没有添加多肽或IFN-γ的B16F10细胞上，估计每个细胞表达＜100 Trp2/H2-Kb分子，但IFN-γ剂量滴定使这一数字增加到约800-1000，导致适度的ADCC报告基因激活。

鉴于TCRm在诱导针对低表达肿瘤抗原的有效ADCC方面的局限性，试图探索Trp2特异性TCRm抗体的其他形式，这些模式可能更有效地限制抗原剂量。因此，生成了一个TCRm双特异性T 细胞结合器(TCRm-BiTE)，包括Trp2/H2-Kb TCRm scFv克隆13和2C11 anti-CD3e scFv，以将T 细胞招募到肿瘤细胞。首先证明了TCRm-BiTE可以剂量依赖的方式杀死不表达Trp2的Trp2多肽脉冲的EL4细胞，验证了TCRm-BiTE的活性。然后，遵循在ADCC和成像试验中建立的实验条件，在存在和/或不存在Trp2多肽和IFN-γ的情况下检测B16F10的杀伤作用。TCRm-BiTE在没有脉冲肽或IFN-γ预处理的情况下，即使在内源性条件下也表现出对B16F10细胞的强烈细胞毒活性还仔细评估了单独的anti-CD3e 2C11 scFv和BiTE非特异性作用，发现2C11 scFv单独对B16F10以及多肽脉冲的EL4和MC38细胞株有微弱的杀伤作用，表明2C11可以引起某种程度的非特异性杀伤活性，与BiTE的TCRm scFv部分无关。总之，证明了TCRm-BiTE能够通过对Trp2等极低密度抗原的特异性识别而触发B16F10肿瘤细胞的细胞溶解。

还探索TCRm抗体在以CAR-T形式呈现时的实用性。用scFv克隆13替换anti-CD19 CAR-T构建体中的scFv，将其克隆到GFP+ CAR盒中，并进行了体外肿瘤杀伤实验。用scFv13 CAR转导的小鼠T 细胞与B16F10细胞以效靶比1:1、3:1和10:1孵育，DAPI染色检测B16F10细胞死亡情况。对B16F10细胞的杀伤从E:T=1:1开始，在没有IFN-γ处理的情况下在10:1达到大值，这表明scFv13 CAR即使在天然低抗原密度(每个细胞＜100 分子)的情况下也能对B16F10细胞产生反应。用IFN-