癌症一直是生物学研究的热门话题。关于癌症起源,一种主流观点是癌症干细胞(Cancer Stem Cell,CSC)的无限增殖。CSC是肿瘤内肿瘤细胞的一个亚类,具有自我更新和异常分化能力。CSC不仅调控肿瘤的发生、传播和维持,还有助于肿瘤的化疗耐药性和复发。因此迫切需要探索影响生物活性的因素,特别是CSC分化。长链非编码RNA(lncRNA)作为基因表达的调控因子,在CSCs的细胞活性中起着关键作用。然而RNA(特别是lncRNA)的表观遗传调控机制尚未得到广泛探索。
N6-甲基腺苷(m6A)可逆修饰在转录后和翻译调控中起着至关重要的作用。m6A修饰对干细胞和癌症干细胞的干性维持和分化具有影响。但lncRNA的m6A修饰及其对CSC的影响仍未探索。
浙江大学生命科学学院章晓波教授团队对胃癌(GC)患者中分离的胃癌干细胞(GCSCs)和胃癌非干细胞(GCNSCs)的lncRNA m6A修饰差异进行表征,揭示了位点特异性lncRNA PSMA3-AS1和MIR22HG m6A修饰通过增加miRNAs和蛋白质的稳定性,抑制凋亡和促进增殖,从而促进GCSCs的肿瘤发生。
标题:Methylated lncRNAs suppress apoptosis of gastric cancer stem cells via the lncRNA-miRNA/protein axis(甲基化的lncRNA通过lncRNA-miRNA/蛋白轴抑制胃癌干细胞的凋亡)
时间:2024.4.10
期刊:Cellular & Molecular Biology Letters
影响因子:IF 8.3 / 1区
实验方法:MeRIP-seq、MeRIP-qPCR等
研究摘要:
背景:长链非编码RNA(lncRNA)在胃癌的肿瘤发生中起着至关重要的作用。然而,lncRNA甲基化对胃癌干细胞(GCSC)的影响尚不清楚。
目的:探究lncRNA甲基化在GCSCs中的作用及其对胃癌发生的贡献。
方法:
· 通过甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)检测胃癌干细胞中lncRNA的N6-甲基腺苷(m6A)水平,并通过MeRIP定量聚合酶链反应(MeRIP-qPCR)进行验证。
· 通过基于单碱基延伸和连接的qPCR扩增(SELECT)检测lncRNA上m6A特异性修饰位点。
· 构建并转染与催化失活的Cas13(dCas13b)融合蛋白的表达甲基转移酶样3(METTL3)质粒,并诱导靶向lncRNA特异性甲基化位点的RNA,获得具有lncRNAs位点特异性甲基化的胃癌干细胞。
· 使用逆转录(RT)-qPCR和Western blot分析处理后的胃癌干细胞的细胞干性(stemness)。
结果:
PSMA3-AS1和MIR22HG的位点特异性甲基化抑制了GCSCs的细胞凋亡并促进其细胞干性。
LncRNA甲基化增强了PSMA3-AS1和MIR22HG的稳定性,通过PSMA3-AS1–miR-411-3p–或MIR22HG–miR-24-3p–SERTAD1轴抑制GCSC的凋亡。
甲基化的lncRNAs促进了PSMA3-AS1与EEF1A1蛋白或MIR22HG与LRPPRC蛋白之间的相互作用,稳定了蛋白并抑制细胞凋亡。
体内数据显示,甲基化的PSMA3-AS1和MIR22HG触发了GCSCs的肿瘤发生。
结论:
本研究揭示了lncRNAs位点特异性甲基化在GCSCs肿瘤发生中的必要性,为癌症发展提供了新的见解。
结果图形:
(1)GCSC中的lncRNA m6A甲基化
· GCSC和GCNSC肿瘤球形成百分比。
· GCSC的单个细胞的肿瘤球形成分析。
· 用Western blot检测GCSCs和GCNSCs中干性基因的表达。
· GCSC迁移的效率。对GCSC和GCNSC进行Transwell迁移测定以检查细胞迁移。
· GCSC的化学抗性。用不同浓度的顺铂处理GCSC或GCNSC。处理后48小时,对细胞进行细胞活力测定(**p<0.01)。计算半数大抑制浓度(IC50)值。
· GCSC和GNCSC中RNA的m6A修饰。
· GCSC和GNCSC中差异表达的m6A修饰 lncRNA热图。
· 甲基化lncRNAs在GCNSCs和GCSCs中的表达谱。**p<0.01
(2)GCSCs中的lncRNA甲基化机制
· 从HGC-27(GCSC-HGC)和MGC-803(GCSC-MGC)分选的GCSC单个细胞的肿瘤球形成测定。
· GCSC-HGC和GCSC-MGC中干性基因的Western blot分析。
· GCSC(GCSC-HGC和GCSC-MGC)的迁移能力。用Transwell迁移测定法分析GCSC-HGC、GCNSC-HGC、GCSC-MGC和GCNSC-MGC以检查细胞迁移。迁移细胞的代表性图像显示在左侧。迁移细胞的百分比显示在右侧(**p<0.01)。
· GCSC(GCSC-HGC和GCSC-MGC)的化学抗性效率。用不同浓度的顺铂处理GCSC或GCNSC。处理后48小时,用细胞活力测定(**,p < 0.01)。计算半数大抑制浓度(IC50)值。
· 检查GCSC中甲基转移酶METTL3和METTL14的表达。
· 用METTL3 shRNA或METTL3 shRNA拯救GCSC中METTL3的Western blot。
· 具有METTL3 shRNA或METTL3 shRNA拯救的GCSC中lncRNA的m6A水平。
· 使用Western blot检测METTL3沉默或拯救的GCSC中干性基因的表达。β-tubulin蛋白用作对照。
· METTL14 shRNA或METTL14 shRNA拯救GCSC中METTL14的Western blot。
· 使用METTL14 shRNA或METTL14 shRNA拯救的GCSC中lncRNA的m6A水平。
· 通过Western blot检测METTL14沉默或拯救的GCSC中干性基因的表达。**p<0.01
(3)甲基化lncRNAs在GCSCs中的作用
· GCSC中六种lncRNA(PAPPA-AS1、PSMA3-AS1、MIR22HG、LINC00342、LINC01410和LINC00680)的表达谱。
· 验证GCSC中lncRNA沉默。
· 用lncRNAs siRNA检测GCSCs中干细胞基因的表达。
· PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSCs的细胞活力。
· PSMA3-AS1或MIR22HG沉默的GCSC的细胞周期分析。
· 用于PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSC的Caspase-3/7检测。
· 预测lncRNA的甲基化位点。
· GCSC和GCNSC之间lncRNA的m6A水平。
· METTL3沉默的GCSC的m6A水平与lncRNA的位点特异性甲基化。
· 具有lncRNA位点特异性甲基化的METTL3沉默的GCSC的细胞活力。
· 具有lncRNA位点特异性甲基化的METTL3沉默的GCSC的细胞周期分析。
· 用于METTL3沉默的GCSC的Caspase-3/7检测,其具有lncRNA的位点特异性甲基化。
· Western blot检测METTL3沉默的GCSCs的干细胞基因与lncRNAs的位点特异性甲基化。
· lncRNA位点特异性甲基化的METTL3沉默的GCSC的肿瘤球形成百分比。
· 用甲基化的lncRNA对METTL3沉默的GCSC的单细胞进行肿瘤球形成检测。**p<0.01
(4)m6A修饰对lncRNAs稳定性的影响
· METTL3沉默的GCSC中lncRNA PSMA3-AS1和MIR22HG的相对表达水平。
· 用放线菌素D处理METTL3沉默的GCSCs的lncRNAs稳定性。
(5)lncRNAs在GCSCs中的潜在机制
· GCSC中的lncRNA-miRNA互作的相对富集。
· 双荧光素酶报告基因检测GCSC中潜在的miRNA-lncRNA互作。
· miR-411-3p和miR-24-3p在GCSCs和GCNSCs中的表达谱。
· 使用microT、miRmap和TargetScan预测miRNA的潜在靶基因。
· 验证GCSC中miRNA的过表达。
· 检测miRNA过表达的GCSC中靶基因表达水平。
· 通过双荧光素酶报告基因测定验证miRNA与靶基因的互作。
· GCSCs和GCNSCs中miRNA靶基因的表达水平。
· GCSC和GCNSC中miRNA靶基因的Western Blot。
· 用于AP1G1或SERTAD1沉默GCSC的Caspase-3/7检测。
· Western Blot分析AP1G1或SERTAD1沉默GCSC中的干性基因。
· PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSC中AP1G1或SERTAD1的表达水平。
· Western Blot分析PSMA3-AS1或MIR22HG沉默的GCSC中miRNA的靶基因。**p<0.01
(6)m6A修饰的lncRNA与蛋白质互作
· 用于lncRNA下拉分析的SDS-PAGE。箭头表示鉴定出的蛋白质。M:protein marker。
· 与lncRNA结合的蛋白质Western Blot分析。
· 检测PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSC中与lncRNA结合的蛋白质稳定性。
· GCSC中EEF1A1和LRPPRC的mRNA和蛋白质水平。
· 通过RT-qPCR和Western Blot分析验证GCSC中EEF1A1或LRPPRC的沉默。
· EEF1A1或LRPPRC沉默GCSC的细胞活力。