纳米金及其标记细胞色素P450的近红外荧光性质的研究

【摘要】  目的 研究纳米金及其标记细胞色素P450在811?nm近红外荧光光谱的特性，并对其荧光增强机理进行深入的探讨。方法 用不同量的柠檬酸三钠在煮沸搅拌条件下还原氯金酸制得不同粒径的纳米金，利用纳米金易与蛋白结合的性质标记细胞色素P450。用紫外-可见吸收光谱仪、投射电子显微镜以及荧光光谱仪，研究纳米金及其标记细胞色素P450的光谱性质。结果 透射电子显微镜显示随着还原剂柠檬酸钠加入量的增加，形成的纳米金的颗粒逐渐减小。紫外-可见吸收光谱显示大颗粒纳米金只在250?nm处有吸收,当纳米金粒径的减小至21?nm时，在525nm处出现新的吸收峰。荧光光谱仪显示以538?nm为激发波长，纳米金在811?nm处有荧光发射峰，且标记蛋白后荧光强度增加。结论 通过对纳米金近红外荧光性质的研究，可利用纳米金的近红外荧光性质作为探针检测细胞色素P450。

【关键词】  纳米金 近红外荧光 细胞色素P450

    Abstract： ob[x]jective  To explore the infrared fluorescence of the gold nanoparticles （AuNPs） and their labeled Cytochrome P450 at 811 nm, and to explore its mechanism. Method  Different sizes AuNPs were obtained by adding different amount of trisodium citrate to reduce the chloroauric acid in a boiled and stirred condition, and then the protein was labeled by AuNPs. The AuNPs and its labeled Cytochrome P450 were observed by the UVvisible light absorption spectrum, transmission electron microscopy (TEM) and fluorescence spectrum. Results  With an increase of the trisodium citrate， the AuNPs became smaller under TEM. The absorption peak of the larger AuNPs was at 250?nm under the UVvisible spectrum, and when the AuNPs were reduced to 21?nm, the absorption peak was at 525?nm. When it was excited at 538?nm, the emission peak was at 811?nm. and the intension was enhanced after it was labeled by the protein. Conclusion   Infrared fluorescence of the AuNPs can be used as a probe to determinate  Cytochrome P450.

    Key words： Gold nanoparticles（AuNPs）; Infrared fluorescence; Cytochrome P450    随着科学技术的发展，人们发现一些金属材料在特定的条件下可以将其尺寸减小到纳米级别，此时形成的纳米粒子具有量子尺寸效应和表面效应，往往会表现出一些独特的光学和电学性质，这些理化性质引起了人们的广泛兴趣，并对其进行了深入地研究［13］。朱键等［4］利用电化学方法合成了20 40?nm左右的金纳米粒子，并研究了它们的光致发光性质,发现这些大颗粒的金纳米粒子在紫外和可见区可发射光致发光。为了使粒径很小的纳米粒子在溶液中能够稳定存在，人们合成了单层保护的［56］, 并研究了它们的光谱性质，发现粒径很小（＜2?nm）的金纳米簇的特征等离子体吸收带消失，而代之出现从近红外至紫外吸光度稳定增加的吸收光谱，但这些粒子可以发射可见荧光和近红外荧光［7］。随着粒子变小，发射峰蓝移；而发光强度不仅与纳米粒子粒径和形状有关，而且与配体保护层的化学性质有关，因此粒径小于2?nm的金纳米簇引起了人们的广泛注意。

    本文采用Frens液相柠檬酸钠还原法制得稳定的纳米金纳米溶液，并用其标记细胞色素P450等蛋白质，研究了纳米金及其标记细胞色素P450等蛋白后的紫外-可见吸收光谱特性和荧光光谱特性，研究发现，15?nm左右的纳米金能发射811.2?nm的近红外荧光，而细胞色素P450能够明显增强纳米金的近红外荧光强度，并对其荧光强度影响因素和增强的机理进行探讨。

    1  材料与方法

    1.1  仪器和试剂  UV2540型紫外-可见分光光度计（Hitachi）；F4500型荧光分光光度计（Shimadzu）； 透射电子显微镜 （日本日立公司）；电动搅拌器（上海标准模型厂）； 氯金酸（分析纯,国药化学试剂有限公司）；柠檬酸三钠(分析纯,中国联试化工试剂有限公司)； 细胞色素P450（美国Sigma公司）; 乙醇、甲酸、乙腈（色谱纯,天津四有化学试剂公司）。

    1.2  纳米金的制备  纳米金采用Frens法制备：量取50?mL水加入200?mL锥形瓶中，加入0.1%的氯金酸1?mL，煮沸后搅拌条件下加入1%柠檬酸三钠，加入不同的量（150?μL、100?μL、80?μL、50?μL、30?μL、20?μL）可以制得不同颗粒大小的纳米金。柠檬酸三钠的量较多时，溶液的颜色在2 3?min内由淡黄色变成紫色，逐渐变成红色；柠檬酸三钠的量较少时，溶液颜色呈现蓝色，继续加热搅拌15?min后，冷却至室温，用去离子水定容至50?mL,得到纳米金溶液。  

    1.3  纳米金标记细胞色素P450  根据纳米金与蛋白可以直接结合的性质，在Eppendorf管中加入制备好的纳米金200?μL，后加入200?μL浓度为1.25×10-6g/L的细胞色素P450,加入600?μL的去离子水,涡旋混匀，静置10?min后测定。

    2  结  果

    2.1  投射电镜图  用透射电子显微镜（TEM）对纳米金颗粒的大小进行了观察(图1)，当柠檬酸三钠与氯金酸得比率为1?mL∶20?μL时纳米金颗粒大小为30 40?nm,比率为1?mL∶30?μL时大小为20 30?nm，比率为1?mL∶150?μL时颗粒大小为15 20?nm，结果表明随着还原剂柠檬酸三钠与氯金酸的比率的增加，形成的纳米金颗粒的直径逐渐减小。图1  柠檬酸三钠与氯金酸不同比率条件下的纳米金颗粒大小

    2.2  紫外-可见吸收光谱  用紫外-可见分光光度仪测定纳米金及标记细胞色素P450后的吸收光谱（图2），大颗粒纳米金(24?nm)只在250?nm处有吸收, 且随纳米金粒径的减小，其吸光度逐渐降低，当纳米金粒径的减小至21?nm时，在525?nm处出现新的吸收峰。

    2.3  荧光光谱  用荧光分光光度计测定纳米金及其标记蛋白的荧光性质（图3）, 由图3可见纳米金的激发峰为538?nm，依此为激发光，纳米金体系在近红外811?nm处有一发射峰，依此为激发光时P450The UVvisible absorption spectrum of the gold nanoparticles在811?nm处无发射荧光，且纳米金标记细胞色素P450后在811?nm处荧光强度与纳米金相比有了明显的增加。图3  纳米金的激发光谱（a）及发射光谱（b）

    2.4  纳米金与蛋白作用条件的实验

    2.4.1  颗粒大小的影响  通过改变还原剂与氯金酸的量之比制得不同颗粒大小的纳米金粒子，观察纳米金颗粒的大小对811?nm处体系荧光强度的影响，结果表明随着纳米金颗粒的直径增加，纳米金荧光强度逐渐降低，标记蛋白后体系荧光强度增强亦不相同，在颗粒较小时荧光强度增加大，因此，本实验采用15 20?nm颗粒大小的纳米金。

    2.4.2  pH影响的选择  用缓冲溶液调节pH值，观察溶液的pH值对荧光强度的影响，结果表明在pH为9.0时，体系的荧光强度强，说明在碱性条件下纳米金与蛋白的结合性较好。

    2.4.３  表面活性剂的影响  在体系中加入适量浓度1%的十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）和十六烷基三甲基溴化胺（Hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）表面活性剂，观察表面活性剂对体系荧光强度的影响，结果表明纳米金中加入表面活性剂后使纳米金的荧光强度增加，其中SDS对体系的荧光强度的作用较强，SDS可以增加体系的荧光强度，CTAB对体系的荧光增强作用不明显，本试验采用SDS，其适用量为200?μL。

    2.4.4  修饰剂的影响  以0.5%硫辛酸和巯基乙酸作为修饰剂，观察修饰剂对体系荧光强度的影响。结果显示，纳米金与硫辛酸结合后，荧光强度有明显增加，加入细胞色素P450后体系的荧光强度又有所增加，相对于纳米金的荧光强度而言增加3倍，说明硫辛酸对纳米金荧光有增强作用，而且硫辛酸作为一种修饰剂可以增加纳米金与蛋白结合的荧光强度，其适用量为150?μL。同时使用巯基乙酸作为修饰剂，结果显示巯基乙酸对体系的荧光强度没有增加作用，说明巯基乙酸作为一种修饰剂不能用来增强体系的荧光。

    2.4.5  有机溶剂的影响  向反应体系中加入乙醇、甲酸、乙腈等极型有机试剂，观察极性有机物对于反应体系荧光强度的影响。结果纳米金在加入有机物后荧光强度有明显的增加，乙腈对纳米金的荧光强度的增加作用明显，乙醇次之。有机溶剂对于纳米金-细胞色素P450体系的荧光强度增加更明显，其中乙醇对于体系的荧光增加明显，甲酸次之。这可能是由于纳米金在与蛋白结合时，由于有机试剂的疏水作用，使得体系与水形成界面，有利于纳米金与蛋白的结合。

    2.5  工作曲线及检出限  在佳试验条件下，建立了细胞色素P450浓度（C）和荧光强度变化值（If）之间的工作曲线，细胞色素P450浓度在2.3×10-7 1.0×10-5?g/L范围内与体系的荧光强度呈线性关系，线性回归方程：If=1?380?263.5C-0.318?59，检出限达到2.440?1×10-8?g/L，相关系数为0.989?6。

    3  讨  论 

    P450加入到纳米金体系后，纳米金在811纳米处的荧光强度得到显著增强，这表明纳米金与P450之间发生了相互作用，使得体系的荧光强度有了明显的增强，可能是由于加入修饰剂后，修饰剂带有巯基可以在纳米金与P450之间起到联结作用，使得纳米金-修饰剂P450形成一个复合物，通过对纳米金标记P450后进行电镜观察的结果表明，纳米金颗粒在与蛋白结合后定向排列聚集成超晶格结构，使得表面等离子体传播特性的改变，导致纳米金表面造成了近纳米荧光强度的改变。又通过对纳米金的Zeta点位进行测定，表明纳米金的Zeta电位随着纳米金颗粒的逐渐减小而降低，这有可能是由于小颗粒纳米金与P450的结合性越好，其荧光强度的增加越明显的原因。通过芘I1/I3的测定发现纳米金荧光体系中芘I1/I3测定值为1.245,而纳米金颗粒与P450蛋白质结合后，荧光体系芘I1/I3的测定值降低为1.170，说明结合后体系微环境的极性降低，而疏水性增强，能够减少复合物与水分子之间的碰撞，减少能量损失，从而使纳米金颗粒标记蛋白质体系的近红外荧光强度增强，而表面活性剂和有机物的加入可以为体系提供疏水环境，使得体系的荧光增强，从而验证了疏水环境对荧光强度增强的作用。

    在疏水环境下细胞色素P450与纳米金之间形成复合物，使得纳米金在811?nm处的荧光显著增强，在佳条件下，体系的荧光强度与P450的含量在一定范围内呈现线性关系，通过对纳米金在近红外的荧光的性质研究，可能会建立一种测定P450的方法。

【参考文献】

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［7］ Prades J D, Cirera A, Morante J R, et al. Ab initio insights into the visible luminescent properties of ZnO［J］. Thin Solid Films, 2007, 515(24):86708673.

作者：尹洪银

作者单位：山东大学公共卫生学院， 济南 250012