两种CpG ODN佐剂对小鼠白血病局灶瘤的抗瘤作用研究

【摘要】  为了比较免疫佐剂CpG ODN1826和CpG ODN2006在白血病局灶肿瘤动物模型中的抗瘤作用和，筛选合适的免疫佐剂，建立了急性淋巴细胞白血病局灶肿瘤动物模型，在不同时间用灭活的L1210细胞和不同免疫佐剂给DBA/2小鼠皮下注射，观察小鼠一般状况、成瘤率、瘤块生长情况，了解瘤块病理情况。结果表明：灭活细胞加CpG ODN1826瘤苗可以降低小鼠成瘤率，成瘤小鼠的瘤块生长缓慢，瘤块内部肿瘤细胞坏死明显，但生存期无明显延长；CpG ODN2006组小鼠成瘤率不但降低，瘤块缩小，而且生存期也明显延长，已生长的肿瘤消退。结论：应用CpG ODN2006瘤苗可以增强白血病局灶肿瘤小鼠的抗瘤作用，使生存期明显地延长，无明显的。

【关键词】  白血病

    Antitumor Effect of Two Adjuvants of CpG ODN on Leukemic Tumor in Mouse Models

    HE AiLi, CHEN Hong, ZHANG WangGang, CAO XingMei, ZHAO WanHong

    Department of Hematology, The Second Hospital, Xi′an  Jiaotong University Medical School, Xi′an 710004, China

    Abstract    To investigate  the antitumor and side effect of CpG ODN 1826 and CpG ODN2006 as an adjuvants on leukemic tumor in mousemodels, an acute lymphocytic leukemic tumor in mouse  model  was established, then inoculated inactivated L1210 cells alone or with different vaccine adjuvants were injected  subcutaneously  into each DBA/2 model mouse at different times. The activities of mice, the tumor formation rate and the growth status of leukemic tumor were observed. The tumor was examined by pathologic section. The results showed that the vaccine of inactivated L1210 cells and CpG ODN 1826 could decrease the leukemic tumor formation rate, slow down the growth of leukemic tumor mass in mice and obviously cause necrosis of tumor cells, but it could not prolong the life spans of the tumorburden mice; while CpG ODN2006 could not only decrease the tumor formation rate, slow down  the growth of tumor mass in mice and result in  obvious necrosis of tumor cells, but also  could eliminate the existing tumor mass in mice, and  prolong the life spans of the tumorburden mice. It is concluded that using CpG ODN2006 as an adjuvant  enhances the antitumor effect against the leukemic tumor, prolong the life span of tumorburden  mice  without obvious side effect.

    Key words    leukemia; tumor vaccine; cytidinephosphatteguanonine oligodeoxynucleotides

    J Exp Hematol 2007; 15(5):1042-1045

    白血病的免疫治疗，长期以来一直受到人们的重视。随着生物科学技术的发展，肿瘤疫苗已经从早期的单纯灭活肿瘤细胞疫苗到今天的利用生物工程建立基因修饰肿瘤疫苗等多种形式。我科曾经应用白血病瘤苗，主动免疫治疗白血病患者，取得了良好疗效［1］，但大多患者注射局部红肿硬结，疼痛，很难坚持治疗，这提示我们寻找作用效果更好、副作用更小的免疫佐剂。我们通过白血病局灶肿瘤动物模型观察免疫佐剂CpG ODN1826和CpG ODN2006的抗白血病局灶肿瘤作用和毒副反应，为临床治疗提供实验依据。

    材料和方法

    动物及肿瘤细胞

    DBA/2小鼠，雌雄各半共38只，体重22-28克，购自第四军医大学动物中心，为二级清洁动物。小鼠白血病细胞株L1210由西安交通大学生命科学院惠赠。

　　两种CpG ODN佐剂对小鼠白血病局灶瘤的抗瘤作用研究  主要试剂

    GpG ODN1826 TCCATGACGTCCCTGACGTT全硫逐磷酸骨架，CpG ODN2006  TCGTCGTTTCGTTTT     GTCGTT全硫逐磷酸骨架，为Coley公司产品；丝裂霉素C购于上海金康制药公司。

    小鼠白血病模型的制备

    取对数生长期的L1210细胞，用PBS洗3遍，调整浓度至1×105/ml，于每只小鼠右肋下皮肤分别注射0.1  ml（即5×104个肿瘤细胞），5-7天后可触及皮下结节。

    小鼠肿瘤疫苗的制备

    收获处于对数期生长的L1210细胞，800 rpm离心8分钟，加入丝裂霉素C（终浓度为100 μg/ml），于37℃水浴中放置30分钟，用PSB液洗涤3遍后，调整细胞浓度至2×107/ml，作瘤苗备用；将CpG ODN1826和CpG ODN2006 用PBS液分别溶解后，调整浓度至500  μg/ml，备用。

    实验分组

    将小鼠随机分为4组（每组小鼠雌雄各半），每组9-10只小鼠：①CpG ODN1826组：CpG ODN1826（0.1 ml，50 μg）+灭活的肿瘤细胞（0.1 ml，2×106个）；②CpG ODN2006组：CpG ODN2006（0.1 ml，50 μg）+灭活的肿瘤细胞（0.1 ml，2×106个）；③单独治疗组：生理盐水（0.1 ml）+灭活的肿瘤细胞（0.1 ml）；④阴性对照组：生理盐水（0.2 ml）。

    免疫治疗

    于接种肿瘤细胞后的第2，5，8，15天分别给4组小鼠在接种部位对侧肋下皮下注射疫苗或生理盐水0.2 ml。

    观察并记录

    每1-2天，观察记录小鼠的局部注射部位有无红肿、硬结、溃烂等；观察记录小鼠的一般状况、体重变化、食量大小以及是否有惊厥、竖毛、抽搐等现象持续90天。应用游标卡尺测量小鼠肿块大小［2］。

    病理学检测

    切取原接种肿瘤部位、注射疫苗部位皮肤以及心肝脾肾等重要脏器，HE染色，观察肿瘤细胞及炎性细胞浸润情况［3］。

    统计学分析以及处理

    以统计学软件（Original lab）对资料进行统计学处理，成瘤率采用四格表确切概率法；生存时间采用成组设计的两样本配对t检验；p＜0.05为有显著差异。

    结    果

    不同时期免疫治疗后小鼠肿瘤生长情况

    免疫治疗后不同时期小鼠肿瘤生长见表1-3。 CpG ODN1826组的5只小鼠虽然没有肿瘤生长，但4只小鼠全身衰竭死亡，有2只小鼠出现肿瘤消退现象，CpG ODN2006组成瘤率已明显下降，有3只小鼠肿瘤已不能触及（表1、2、3）。

    疫苗治疗后各组小鼠一般状况的观察

    正常DBA/2小鼠精神好，活泼，被毛光滑。小鼠接种肿瘤后，毛发无光泽，杂乱；随着肿瘤的生长，小鼠精神萎靡，活动明显减少，肿瘤生长2 cm×2 cm后，瘤体局部出现破溃、出血，小鼠全身衰竭，恶液质，4组无明显差异（20天内）。接种肿瘤细胞20天后，在CpG ODN1826组与CpG ODN2006组中发现个别小鼠肿瘤消退。在阴性对照组小鼠中发现小鼠尾部有多处隆起。

    CpG ODN1826组和CpG ODN2006组注射后局部形成包块，吸收较快，小鼠无惊厥、躁动，1-2天后包块消失，未发现明显红肿及破溃现象。

    免疫治疗后各组小鼠的生存时间比较

    CpG ODN2006组、CpG ODN1826组、单独治疗组和阴性对照组各有6只、2只、2只和1只小鼠活存（90天），CpG ODN2006组小鼠的活存期与其它组相比，有显著性差异（附图）。

    Figure. Comparisons of life spans between diverse groups of mice.病理检查结果

    肿瘤病理  CpG ODN1862组、CpG ODN2006组和单独治疗组肿瘤生长活跃，镜下可见大量肿瘤细胞生长，并广泛浸润脂肪组织，没有侵袭至肌肉组织。长期生存的小鼠在肿瘤注射部位未发现肿瘤细胞，在重要脏器中未发现肿瘤细胞转移灶。阴性对照组肿瘤细胞广泛浸润脂肪组织，部分浸润至周围横纹肌组织。

    肝、肺转移情况  在所有接种肿瘤细胞的小鼠肺脏中，均未见白血病肿瘤细胞，提示肺部转移可能性小。CpG ODN1862组和CpG ODN2006组在肝血窦以及肝实质内未发现肿瘤细胞转移灶。单独治疗组部分小鼠肝脏内发现了肝血窦内瘤细胞浸润。阴性对照组中4只小鼠有肝脏内瘤转移，少数小鼠肝细胞变性坏死，长期生存小鼠有肝细胞颗粒样变性。

    脾脏情况  在CpG ODN1862组中没有发现肿瘤的4只小鼠中，有2只小鼠的脾脏组织巨噬细胞增生，肿大，淋巴滤泡结构不清，未见生发中心。长期生存的小鼠脾脏未见明显病理变化。其余各组脾脏组织结构基本正常。

    尾部情况  阴性对照组4只小鼠尾部出现单个和多个结节，镜下可见局部早期急性脓肿，未见肿瘤组织和细胞浸润情况，其余3组尾部肉眼观察与病理切片显示均无异常。

    讨    论

    肿瘤的疫苗研究主要有两方面，肿瘤抗原和免疫佐剂的研究。随着对机体逃避免疫监视机制的深入研究，人们认识到佐剂在肿瘤免疫治疗中发挥着很重要的作用，它能提高免疫原性，逆转机体的免疫无能状态，改变机体的免疫应答方向［4］。CpG ODN作为强而有效的免疫刺激剂，一直受到研究者的重视。我们选取的两种CpG序列均为B型CpG序列。根据文献报道［5,6］，A型CpG ODN主要依靠激活NK细胞发挥抗肿瘤作用，单独应用于局部的实体瘤效果较好，而B型CpG OND能激活多种细胞因子的产生，上调免疫细胞表面的分子表达，推测其作为免疫佐剂效果更佳。

    前期的研究表明，CpG ODN1826虽然在白血病小鼠模型中有一定的抗白血病免疫作用，但后期未发生肿瘤小鼠的死亡率增加，提示CpG ODN1826在免疫治疗中有一定的缺陷，还需要对它进行改进或寻找效果更好副作用更少的免疫佐剂。

    通过建立小鼠白血病局灶肿瘤模型，应用两种不同的CpG ODN佐剂和灭活细胞作为瘤苗观察它们的抗瘤作用，结果显示CpG ODN2006组小鼠的成瘤时间与成瘤率与阴性对照组小鼠无显著性差异，随着实验的进行，接受过免疫治疗的小鼠肿块中央出现出血、坏死，并逐渐消退，小鼠一般状况好转，病理切片显示未发生肝脏和肺的转移灶，6只小鼠均长期生存至实验结束（90天），而CpG ODN1826组未成瘤的小鼠衰竭明显，并在短时间内死亡；其它2组肿瘤细胞生长迅速，有肝脏转移灶，说明CpG ODN2006能够作为免疫佐剂，增强机体对肿瘤抗原的反应性，使得L1210白血病小鼠达到治愈［7］。我们推测，其抗肿瘤机理可能是由于CpG序列能够活化多种免疫细胞［8］，产生TNFα，IL6，IFNγ以及IL12等多种细胞因子，促使机体免疫反应向Th1方向进行。这些细胞因子的产生，对于增强肿瘤抗原性具有重要作用。并且由于CpG ODN2006的免疫调节功能，能够抑制Th2因子，而人类肿瘤细胞Th2因子的表达增多，可能与肿瘤的免疫逃逸有关系。CpG ODN2006还可以刺激B细胞产生大量的IL6［9］，IL6作为一种细胞因子有刺激造血干细胞增殖分化，促进B细胞向浆细胞转化参与炎性反应等功能。陈春燕等［10］应用合成的CpG ODN2006作用于髓系白血病HL60细胞，发现了CpG ODN2006能够诱导HL60向单核/巨噬细胞分化，并且参与诱导白血病细胞的凋亡，而对照组的CpG ODN却无此作用，这为白血病的免疫治疗提供了新的途径。

    CpG ODN与灭活的肿瘤细胞混合后，注射于机体的局部，通过活化局部的免疫微环境，增强抗原呈递细胞对肿瘤抗原的呈递，活化肿瘤特异性杀伤的淋巴细胞，并从注射部位的微环境逐步扩展至机体，使得免疫原性很低的肿瘤抗原为机体所识别，通过依赖抗体的细胞介导细胞毒性（ADCC）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）作用达到消除肿瘤的目的［11］。CpG ODN2006作为免疫佐剂，在实验中没有发现明显的副作用。

    我们的实验证明了CpG ODN2006作为免疫佐剂，在小鼠淋巴细胞白血病局灶肿瘤模型中应用的有效性和安全性，为临床应用瘤苗治疗白血病可能提供了实验依据。

 

【参考文献】

1Zhang WG, Liu SH, Cao XM, et al. A phaseI clinical trial of active immunotherapy for acute leukemia using inactivated autologous leukemia cells mixed with IL2,GMCSF, and IL6. Leuk Res, 2005; 29:3-9

2姜扬文，钱莉，蒋桂花等.bcrabl基因疫苗对小鼠SP2/0/bcrabl移植瘤的影响.中国实验血液学杂志.2006; 14：800-803

3鞠佃文，曹雪涛，王宝梅等.大肠杆菌CD自杀基因与GMCSF基因联合转移对小鼠白血病的治疗作用.中华血液学杂志，1998; 19：294-298

4王振义，陈秋生.急性白血病免疫治疗的研究现况和前景.中国实验血液学杂志, 2005; 13：169-173

5Sivori S, Falco M, Della Chiesa M, et al. CpG and doublestranded RNA trigger human NK cells Tolllike receptors :induction of cytokine release and cytotoxicity against tumor and dendritic cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2004；101:10116-10121

6Gursel M, Verthelyi D, Klinman DM. CpG oligodeoxynucleotides induce human monocytes to mature into functional dendritic cells. Eur J Immunol, 2002； 32:2617-2622

7魏虎来，贾正平，赵怀顺等. TAK细胞和IL2脂质体联合硒酸脂多糖抗白血病效应的研究. 中华生物学和免疫学杂志，1998；18：410-413

8GuzylackPiriou L, Balmelli C, McCullough KC, et al. TypeA CpG oligonucleotides activate exclusively porcine natural interferonproducing cells to secrete interferonalpha, tumor necrosis factoralpha and interleukin12. Immunology, 2004； 112:28-37

9Decker T, Hipp S, Kreitman RJ, et al. Sensitization of Bcell chronic lymphocytic leukemia cells to recombinant immunotoxin by immunostimulatory phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Blood, 2002； 99:1320-1326

10陈春燕，贾继辉，潘祥林等.CpG ODN诱导白血病HL60细胞分化和凋亡的研究.中国病理生理杂志，2004；20：407-411

11Zelenay S, Elias F, Flo J. Immunostimulatory effects of plasmid DNA and synthetic Oligodeoxynucleotides Eur J Immunol,2003； 33:1382-1392

作者：何爱丽,陈 虹,张王刚,曹星梅,赵万红

作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院血液科， 西安 710004