巯基乙酸对小鼠MⅠ/MⅡ期卵母细胞进程及结构的影响

【摘要】  目的 探讨巯基乙酸(TGA)对卵母细胞体外成熟的影响。方法 采用小鼠卵母细胞体外成熟和免疫荧光染色法，观察巯基乙酸处理后小鼠MⅠ/MⅡ期卵母细胞的成熟进程和形态结构。结果 对照组、0.005 mg/ml TGA组和0.020 mg/ml TGA组生发泡破裂率分别为48.67%、62.67%和56.00%，极体排出率分别为26.47%、65.96%和45.24%，0.005 mg/ml处理组极体排出率高于对照组和0.020 mg/ml组，差异有统计学意义(P＜0.05)。随着TGA处理剂量的增加，卵母细胞纺锤体和染色体形态结构异常的细胞比例和异常程度增加，0.020 mg/ml TGA处理组与对照组有显著性差异。结论 巯基乙酸可促进卵母细胞体外减数分裂的重启和成熟，但中期卵母细胞的纺锤体及染色体有结构缺陷，对后续胚胎发育可能会产生潜在影响。

【关键词】  巯基化合物； 卵母细胞； 毒性作用

    Effect of TGA on maturing progress and structure of MⅠ/MⅡ stage oocytes in mice  HOU Shaoying1, ZHANG Ling1, WU Kun1, XIA Lei2.  1.Department of Nutrition and Food Hygiene, Harbin Medical University, Heilongjiang  150081, China; 2.First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Heilongjiang  150001, China

    【Abstract】  ob[x]jective  To explore the effect of Thioglycolic acid (TGA) on maturating progress and structure of MⅠ/MⅡ stage oocytes in mice. Methods  In vitro maturation and immunofluorescence stainings were adopted to observe the maturing progress and structure of MⅠ/MⅡstage oocytes treated with TGA. Results  The percentage of oocytes with GVBD in control, 0.005 mg/ml TGA and 0.020 mg/ml TGA group were 48.67%were 62.67% and 56.00%, respectively, and the percentage of oocytes with PB1 formation were 26.47%, 65.96% and 45.24%, respectively. The percentage of PB1 formation in 0.005 mg/ml TGA group was significantly higher than that in control and 0.020 mg/ml TGA group. Percentage and extent of abnormal configuration of spindle and chromosomes in oocytes at me[x]taphase stage increased with the increasing of TGA dose. In contrast to the control, the percentage in 0.020 mg/ml TGA group was significantly lower. Conclusions  Improving resumption of meiosis and meiosis maturation of oocytes cultured in vitro and inducing aberration in configuration of spindle and chromosomes, TGA might have patent harm to subsequent embryo development.

    【Key words】  Sulfhydryl compounds; Oocytes; Toxic actions

    (Chin J Dis Control Prev 2007，11(3)：263266)

    巯基乙酸(Thioglycolic acid，TGA)是持久性卷发剂的主要功效成分，随着烫发的日益普遍，人体接触巯基乙酸的机会和剂量也越来越多。研究［1～3］表明，巯基乙酸对小鼠有急性毒性、亚慢性毒性，生殖毒性和致突变性，可致肝肾损伤，干扰免疫功能。理发员或烫发者可能接触到的巯基乙酸剂量能引起上述效应［2］。生活中，理发员及烫发者多数为女性，但巯基乙酸对雌性生殖功能影响的研究资料却很少。成年脊椎动物卵巢中卵母细胞停滞在第1次减数分裂的G2期末，即生发泡(germinal vesicle,GV)期，每个生殖周期在孕激素的作用下，部分卵母细胞发生生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)，恢复第1次减数分裂，进入第1次减数分裂中期(me[x]taphaseⅠ,MⅠ)，之后发育并停滞于第2次减数分裂中期(me[x]taphase Ⅱ,MⅡ)，成为可受精的卵。为探讨TGA对女性生殖系统的毒性作用机制，本研究对昆明种小鼠卵母细胞进行体外培养，观察TGA对卵母细胞成熟进程和形态结构的影响，以阐明其对雌性生殖细胞早期发育的潜在危害。

    1  材料和方法

    1.1  试剂  巯基乙酸、M2培养液、M16培养液、矿物油、DABCO、IBMX、碘化丙啶(propidium iodide,PI)均购自Sigma公司，青霉素和链霉素(hyclone)，孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)购自宁波第二激素厂，BSA(promega)，TritonX 100(ameresco)，兔抗小鼠tubulin抗体(lab vision corporation)，FITC标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

    1.2  实验材料  实验动物为4～6 w的清洁级昆明种雌性小鼠(哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供，合格证号SCXK(黑)20022002)，实验前于饲养环境下适应至少1 w，控制温度(20～22 ℃)、光照时间(8∶00～20∶00)和相对湿度(30％～50％)，动物自由摄水进食。

    1.3  方法

    1.3.1  培养液的配制  M2、M16培养液分别作为采卵液和培养液，使用前添加100 IU/ml的青霉素和100 μg/ml的链霉素。TGA储备液用去离子水配制，用10 N NaOH调整pH至7.2，分装保存于-20 ℃。TGA工作液用M16培养液配制，即将TGA储备液分别稀释成0.005 mg/ml和0.020 mg/ml，对照组为M16培养液。将各处理组培养液于35 mm培养皿中制作成微滴(50 μl/滴)，上覆盖矿物油，置37 ℃、5％ CO2培养箱中至少平衡2 h备用。

    1.3.2  卵母细胞的收集和处理  小鼠腹腔注射10IU PMSG，48 h后颈椎脱臼处死，立即取双侧卵巢于添加0.2 mmol/L IBMX的M2培养液中，体视显微镜下用29号针头刺破半透明状卵泡，释放卵母细胞。选取裸卵，用M16培养液清洗3次，随机分配到各组中，于37 ℃、5％CO2培养箱培养16 h。

    1.3.3  卵母细胞核成熟的判定  卵母细胞体外培养16 h后，体视显微镜下检测卵母细胞GVBD和成熟情况，以排出极体(polar body 1,PB1)作为成熟的标志。GVBD率=GVBD细胞数/活细胞总数×，PB1排出率=排出PB1细胞数/GVBD细胞数×。

    1.3.4  卵母细胞纺锤体和染色体的形态学观察  采用间接免疫荧光标记法对卵母细胞进行染色，所有操作都在置有100 μl微滴的35 mm培养皿中进行。将卵母细胞从各组取出，于清洗液(含0.1% BSA的PBS)中清洗3次后，移入4%多聚甲醛液滴，室温下固定30 min。用含0.5% TritonX 100的PBS于37 ℃下处理15 min，以增加卵母细胞膜透性。之后将卵母细胞移入封闭液滴(含1%BSA的PBS)，37 ℃下处理1 h。把兔抗小鼠tubulin抗体在封闭液中按1∶100稀释并作成液滴，将卵母细胞移入，37 ℃孵育2 h。然后将卵移入用封闭液1∶200稀释的FITC标记山羊抗兔IgG液滴中，室温避光孵育1 h。后，用5 μg/ml PI室温避光孵育3 min，对核DNA进行荧光染色。其中，每步操作后都用清洗液将卵母细胞清洗干净；同时，为防止液滴干涸，凡处理时间长于10 min的步骤，均在湿盒中进行。染色结束后，将细胞移入滴有DABCO的载玻片上，用盖玻片覆盖并用指甲油封片，-20 ℃避光保存。在Nikon激光共聚焦显微镜下观察并照相。

    1.4  数据分析  每组实验至少重复3次，采用SPSS统计软件进行分析，组间比较采用χ2检验和Fisher确切概率检验，检验水准α=0.05。

    2  结果

    2.1  TGA对小鼠MⅠ期卵母细胞体外成熟的影响  本研究对卵母细胞培养16 h，判断GVBD发生和PB1排出情况。由表1可以看出，处理1组和处理2组生发泡破裂率均高于对照组，但经统计学处理，各组间差异无统计学意义(P＞0.05)；两个处理组的极体排出率均较对照组升高，且处理1组明显高于对照组和处理2组，差异均有统计学意义(P均＜0.05)表1  TGA处理16 h对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

    2.2  TGA对MⅡ期小鼠卵母细胞纺锤体和染色体结构的影响  为了进一步探讨TGA对卵母细胞成熟过程的影响，本文采用免疫荧光染色的方法，对TGA处理后MⅡ期卵母细胞纺锤体和染色体的形态结构进行观察，结果表明正常成熟卵母细胞形成典型的双极纺锤体，染色体整齐的排列在中期板上，如图1a所示。对照组、处理1组和处理2组分别有90.48%、78.95%、69.57%的卵母细胞具有这种典型的形态，其中处理2组正常细胞率低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。其余卵母细胞有的未被染色或细胞结构形态有异常，其中未被染色的细胞数在各组中差异无统计学意义(P＞0.05)；结构形态异常的细胞在各组的比例分别为9.52%、21.05%和26.09%，异常率随着TGA处理剂量的增加有所增加，处理2组异常率高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。3个组分别有9.52%、15.79%、13.04%的卵母细胞染色体没有凝集，也没有分布于中期板(异常A型，如图1b所示)，但经统计学处理，各组间差异无统计学意义。还有部分卵母细胞没有形成完整的中期板(异常B型，如图1c所示)，该类型异常的细胞在各组分别占0.00%、5.26%、13.04%，处理2组高于对照组，差异无统计学意义(P＜0.05)。从该结果可以看出，随着TGA处理剂量的增加，纺锤体和染色体形态结构异常的细胞比例增加，而且异常的程度也有所加重(表2)。

    3  讨论

    我国从20世纪70年代开始生产TGA，年总产量约2 000吨，国内年需求量在5 000吨以上［4］，其中有90%的TGA生产冷烫精［5］。以往报道TGA有生殖毒性作用，故而具有潜在的健康危害。但迄今对冷烫精的生殖毒性未有充分的认识，也未引起足够的重视。

    本文用TGA处理体外培养的小鼠卵母细胞，探讨了其对卵母细胞成熟过程的影响以及对MⅡ期卵母细胞纺锤体、染色体形态的影响，以便阐明TGA对雌性生殖细胞早期发育的毒性作用。研究发现，2个TGA组卵母细胞的GVBD率和PB1率均高于对照组，可促进体外培养卵母细胞减数分裂的重启和成熟。其中，0.005 mg/ml TGA组PB1率高，与对照组和0.02 mg/ml TGA组差异有统计学意义，表明TGA在较低剂量条件下，可增加卵母细胞成熟的速度和成熟率。

    很多研究［6，7］发现，染色体和纺锤体的结构形态可以反映卵母细胞的成熟状态。动物实验证实，微管和微丝参与受精后胚胎发育，它们的损伤将影响胚胎的发育潜能［8］。纺锤体对卵母细胞染色体的平衡、运动、分配和极体的排出非常关键，纺锤体的异常会导致异常的减数分裂，有可能产生异常的胚胎。该研究结果发现，2个TGA处理组均有部分卵母细胞的染色体没有完全凝集，中期板结构不太完整，染色体没有规则得分布于中期板上或者根本没有形成完整的中期板，异常卵母细胞所占比例随着TGA剂量的增加而有所增加，说明TGA处理对小鼠卵母细胞的纺锤体的形成和染色体的运动均有影响。而且随着TGA处理剂量的增加，纺锤体和染色体聚集异常的严重程度也有增加。综上所述，虽然TGA可促进体外培养小鼠卵母细胞的成熟，但是卵母细胞的结构却有缺陷，可能会影响后续胚胎的发育。但TGA是如何影响纺锤体及染色体的结构尚不清楚，有待进一步从分子水平探讨并阐明。

【参考文献】
  ［1］ 宋春华，甘卉芳. 巯基乙酸的经皮毒性及诱变性研究 ［J］. 工业卫生与职业病, 1990,16(3):145147.

［2］ 甘卉芳,李百祥,吴坤,等. 巯基乙酸经皮毒效应的实验研究 ［J］. 卫生毒理学杂志, 2001,15(2):113.

［3］ 宋春华,甄铁梅,甘卉芳. 巯基乙酸经呼吸道染毒对小鼠免疫功能的影响 ［J］. 中国工业医学杂志, 2002,15(2):7879.

［4］ 李涛. 巯基乙酸的合成进展及应用 ［J］. 河北化工, 2005,28(3):1012.

［5］ 范薇,惠明友. 巯基乙酸生产方法及发展前景 ［J］. 河南化工, 2002,1:46.

［6］ Mattson BA, Albertini DF. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase ［J］. Mol Reprod Dev, 1990,25(4):374383.

［7］ Albertini DF. Cytoplasmic microtubular dynamics and chromatin organization during mammalian oogenesis and oocyte maturation ［J］. Mutat Res, 1992,296(12):5768.

［8］ Men H, Monson RL, Parrish JJ, et al. Detection of DNA damage in bovine me[x]taphase Ⅱ oocytes resulting from cryopreservation ［J］. Mol Reprod Dev, 2003,64(2):245250.

作者：侯绍英， 张岭， 吴坤， 夏蕾

作者单位：哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室， 黑龙江 哈尔滨 150081