人肾小管上皮细胞血清饥饿法同步化方法的研究

【关键词】  肾小管上皮细胞;,,同步化;,,血清饥饿法;,,G0/G1阻滞

　　[摘 要]  目的: 探讨采用血清饥饿法建立将人肾小管上皮细胞（HKC）的同步化方法。方法: 将HKC分为6个不同低血清浓度组及对照组,  分别采用胎牛血清浓度为0、 1、 2、 3、 4、 5和100 mL/L的DMEM培养液培养24 h。根据流式细胞术结果选择的佳同步化HKC的胎牛血清浓度。将HKC的同步化处理时间分别延长为24 h、 48 h和72 h,  选择佳同步化时间。用MTT法绘制生长曲线观察血清饥饿处理对HKC生长的影响。采用免疫细胞化学方法验证血清饥饿同步化处理HKC的效果。结果: 选择无血清（0 mL/L）和1 mL/L为HKC佳同步化的胎牛血清浓度,  选择48 h为HKC同步化佳时间。细胞生长曲线表明采用1 mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养48 h后恢复正常培养的HKC细胞,  其生长曲线更接近于正常培养的细胞。Brdu进一步证明,  用1 mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养48 h可以使90%以上的HKC细胞处于G0/G1期。结论: 用1 mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养48 h可获得90%以上的G0/G1期HKC。

　　[关键词]肾小管上皮细胞;  同步化;  血清饥饿法;  G0/G1阻滞

　　肾小管萎缩和间质纤维化是终末期肾病发生和进行性恶化的主要危险因素之一,  而肾小管萎缩和肾间质纤维化的发生与肾小管上皮细胞周期变化密切相关[1]。因此建立有效的能将肾小管上皮细胞同步化于G0期的方法,  对研究肾小管上皮细胞增殖周期以及由此引起的再生修复或间质纤维化具有重要意义。血清饥饿法是能将细胞周期停滞于G0/G1期同时又较少影响细胞周期发育进程的一种简便有效的同步化方法[2, 3]。目前尚无关于肾小管上皮细胞成熟有效的血清饥饿同步化方法的报道。本研究旨在寻找对人肾小管上皮细胞实施血清饥饿同步化方法的佳条件,  从而为研究HKC增殖周期及肾间质纤维机制提供实验基础。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  人类肾小管上皮细胞（HKC）为本实验室保存细胞系,  DMEM培养液为Gibco公司产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。胰酶为Sigma公司产品。碘化丙啶(PI) 及胰核糖核酸酶（RNaseA）为鼎国公司产品。四唑盐（MTT）及5溴脱氧尿核苷（Brdu）为Sigma公司产品。Brdu抗体为Chemicon公司产品。SP试剂盒为北京中杉公司产品。流式细胞仪为BD公司产品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  细胞培养  HKC使用的培养基为含100 mL/L胎牛血清及青霉素（50 U/mL）、 链霉素（50 U/mL）的DMEM培养液,  培养条件为37℃、 50 mL/L CO2及饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养[4]。（1）不同胎牛血清浓度HKC的培养:  将HKC分为7组,  培养至对数生长期,  弃去培养液,  PBS洗涤3次,  分别加入0、 1、 2、 3、 4和5 mL/L胎牛血清的DMEM培养液,  对照组加入100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液,  培养24 h收获细胞,  每组重复培养3次[5]。（2）不同时间HKC的培养:  将HKC分为6组,  培养至对数生长期,  弃去培养液,  PBS洗涤3次,  分别加入0、 1 mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养24 h、 48 h和72 h收获细胞,  每组重复培养3次[5]。

　　1.2.2  细胞周期检测  用含0.2 mL/L EDTA、 2.5 g/L胰蛋白酶消化上述各组培养细胞,  收集于10 mL的离心管中,  用2.5 mL PBS洗涤2次,  1 000 r/min离心5 min,  弃上清,  加入0.3 mL PBS将细胞混匀,  再加入0.6 mL无水乙醇即振荡混匀,  置4℃冷藏备用。细胞固定24 h后用于检测。细胞样本用PBS洗涤2次,  除去无水乙醇,  加少量PBS将细胞吹散(每份要求细胞数为5～10×105),  加入PI（终浓度为50 mg/L）和胰核糖核酸酶（RNaseA）（终浓度为20 mg/L）,  用流式细胞仪检测G0/G1、 S、 G2/M各期的细胞数[6]。

　　1.2.3  MTT法细胞生长曲线分析  取上述各组培养细胞分别加入100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液,  按每孔500个接种到96孔板,  分7组,  每组设3个复孔。在第1～7天,  每天在同一时间点各取出3孔测试。选择490 nm波长,  在MicroELISA仪上读取数（A）值,  绘制细胞生长曲线[6]。

　　1.2.4  免疫细胞化学检测  将已消毒的20 mm盖玻片置于90 mm培养皿中,  将HKC以2×107/L的细胞数量接种于培养皿中进行细胞爬片,  用1 mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养48 h。于收取细胞爬片前1 h将培养液中加入Brdu（终浓度为10 μmol/L）。收取细胞爬片,  弃去培养液,  PBS清洗3次,  冰丙酮固定15 min。PBS清洗后,  1 mL/L Triton X100 孵育10 min。按SP试剂盒说明,  分别30     mL/L H2O2孵育15 min,  封闭血清（A液）孵育15 min。在4℃条件下加Brdu抗体孵育过夜。清洗后,  37℃条件下再加二抗（B液）孵育15 min,  辣根过氧化物酶（C液）在37℃条件下孵育15 min。DAB显色,  苏木精复染,  树胶封片。显微镜下观察计数10个无重复高倍视野（×400）的细胞阳性率,  取平均值。

　　1.2.5  统计学处理  计量资料以x±s表示,  计数资料用百分比表示,  用SPSS11.0统计学软件进行分析,  组间比较采用LSDt检验,  率的比较采用χ2检验, P＜0.05者具有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  不同胎牛血清浓度HKC培养的结果  为选择HKC血清饥饿法同步化的佳血清浓度,  采用0、 1、 2、 3、 4和5 mL/L 胎牛血清的DMEM培养液培养24 h后,  不含血清（0）和含1 mL/L胎牛血清的DMEM液分别使HKC的G0/G1比例达到（82.7±1.2）%和（80.5±1.0）%,  G2/M期细胞的比例显著降低,  与对照组及其他浓度组有统计学意义（P<0.05,  图1）。

　　图1  不同浓度胎牛血清的DMEM培养24 h后各组HKC细胞周期变化(100 mL/L FBS为对照)（略）

　　aP＜0.05 vs 100 mL/L、 2 mL/L、 3 mL/L FBS、 4 mL/L和5 mL/L FBS组.

　　2.2  不同时间HKC培养的结果  采用0 mL/L和1 mL/L胎牛血清的DMEM液分别培养24 h、 48 h和72 h后,  经流式细胞术检测显示在培养48 h时,  HKC的G0/G1比例分别为（90.9±0.9）%和（93.6±2.0）%,  此时S期细胞和G2/M期细胞的比例显著降低,  与对照组及其他浓度组比较有统计学差异（P＜0.05,  图2、 3)。

　　图2  0 mL/L胎牛血清的DMEM分别培养24 h、 48 h、 72 h后HKC细胞周期变化(0 h为对照)（略）

　　aP＜0.05 vs 0 h、 24 h和72 h 组; cP＜0.05 vs 0 h和24 h组.

　　2.3  MTT法细胞生长曲线分析结果  应用MTT法检测0 mL/L 和1 mL/L胎牛血清浓度以及对照浓度培养48 h后HKC生长情况,  连续检测7 d, 以A值为纵坐标、 生长时间为横坐标绘制生长曲线。结果显示1 mL/L胎牛血清培养液比无胎牛血清培养液同步化后HKC恢复正常培养的生长曲线更接近于正常HKC生长曲线,  表明1 mL/L胎牛血清浓度同步化对HKC生长影响较小（P＜0.05,  图4)。

　　图3  1 mL/L血清浓度的DMEM分别培养24 h、  48 h、  72 h后HKC细胞周期变化（0 h为对照组）（略）

　　aP＜0.05 vs 0 h、 24 h和72 h 组; cP＜0.05 vs 0 h和24 h组.

　　图4  采用0 mL/L、 1 mL/L胎牛血清浓度的DMEM同步化处理后HKC细胞的生长曲线(100 mL/L FBS为对照) （略）

　　aP＜0.05 vs 100 mL/L FBS和1 mL/L FBS组.

　　2.4  免疫细胞化学方法验证同步化效果  采用Brdu免疫细胞化学方法对1 mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养48 h后进行验证。通过计数10个高倍视野的阳性数,  HKC Brdu阳性率为(3.8±0.4)% （P＜0.05）,  与流式细胞术检测结果相符合（图5）。

　　图5  100 mL/L FBS的DMEM培养48 h后HKC细胞的Brdu免疫细胞化学法染色（×400）（略）

　　A:  Brdu阳性HKC细胞;  B:  阴性对照.

　　3  讨论

　　细胞分裂周期是一组和谐的、 高度调节性的系列事件。在形态学上,  细胞分裂周期分为4个时相:  即G1（间期1或者合成前）期、 S（合成）期、 G2（间期2或者为合成后）期和M期。在分裂事件末,  细胞将选择停止（进入G0期）或者进入新的细胞周期。正常肾小管上皮细胞绝大多数处于细胞分裂周期的G0期,  在病理状态下或者受到损伤时,  细胞重新进入细胞周期中。因此,  研究肾小管上皮细胞的细胞周期变化,  首要任务是将其同步化于G0/G1期。能将细胞周期停滞于G0期或G1期的同步化方法有多种,  包括血清饥饿法、 异亮氨酸剥夺法和以化学物质（如洛伐他汀、 含羞草素等）抑制的方法。化学抑制剂可能干扰细胞周期的正常调控过程,  异亮氨酸剥夺法并非对所有的细胞都有效,  而血清饥饿法能将细胞有效并可逆性地停滞在G0期[7, 8],  是一种简便快捷有效的同步化方法,  适用于大多数细胞。应用血清饥饿法时,  应考虑以下3个因素:  （1）所采用的细胞系;  （2）佳血清撤除浓度;  （3）佳同步化时间[8]。佳血清撤除浓度依细胞种类及耐受情况不同,  培养液血清浓度一般在0～5 mL/L,  浓度过低会影响细胞目前及同步化处理后的生长,  甚至可以导致细胞凋亡;  浓度过高则达不到理想的同步化效果。血清撤除时间一般在两个细胞倍增时间之内,  时间太短达不到理想的同步化效果,  时间过长又会刺激细胞生长而削弱同步化作用。因此,  需要针对不同细胞系建立血清饥饿法固定有效的同步化条件。在本研究中,  我们根据不同胎牛血清浓度和不同培养时间的HKC培养,  经流式细胞术检测、 MTT法细胞生长曲线分析和免疫细胞化学方法验证显示,  选择1 mL/L 胎牛血清浓度培养48 h为HKC细胞血清饥饿法的佳同步化实施条件。本研究采用血清饥饿法建立了HKC细胞同步化于G0/G1期的方法,  为深入研究肾小管上皮细胞在急慢性肾脏损伤过程中发挥的作用及机制提供了实验基础。由于在器官移植过程中,  要求供体细胞与受体细胞的细胞周期状态协调一致,  本研究也可能对器官移植具有一定的实际意义。

　　参考文献:

　　[1] Shankland SJ,  Wolf G. Cell cycle regulatory proteins in renal disease:  role in hypertrophy,  proliferation and apoptosis[J]. Am J Physiol Renal Physiol,  2000,  278(4):  F515-529.

　　[2] Kues WA,  Anger M,  Carnwath JW,  et al. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts:  effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors[J]. Biol Reprod,  2000,  62(2):  412-419.

　　[3] Chou RC,  Langan TJ. In vitro synchronization of mammalian astrocytic cultures by serum deprivation[J]. Brain Res Protoc,  2003,  11(3):  162-167.

　　[4] Dai CS,  Yang JW,  Liu YH. Transforming growth factor1 potentiates renal tubular epithelial cell death by a mechanism independent of smad signaling[J]. J Biol Chem,  2003,  278(14): 12537-12545.

　　[5] Zhang EM,  Li XL,  Zhang SF, et al. Cell cycle synchronization of embryonic stem cells:  Effect of serum deprivation on the differentiation of embryonic bodies in vitro[J]. Biochem Biophys Res Commun,  2005,  333(4):   1171-1177.

　　[6] 杜昱蕾,  尹  芳,  杨桂涛,  等. MAD2 RNA干扰载体的构建及其对胃癌细胞生长的影响[J]. 细胞与分子免疫学杂志,  2006,  22(3):  290-292.

　　[7] Campisi J,  Pardee AB. Kinetics of G1 transit following brief starvation for serum factors[J]. Expt Cell Res,  1984,  152(2):  459-462.

　　[8] Schimke RT,  Kung AL,  Rush DF,  et al. Differences in mitotic control among mammalian cells[J]. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol,  1991,  56:  417-425.

　　基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30470802)

　　(第四军医大学西京医院:  肾脏内科,  医教部,  中医科,  陕西 西安 710032)

作者：何丽洁, 王汉民, 杨桂涛, 陈光磊, 陈威, 杨东, 刘宏宝, 白淑蓉, 沈青