四肽化合物CMS030抗移植排斥作用的实验研究

【摘要】  目的：CMS030是从脾脏提取的四肽化合物，本研究观察CMS030对小鼠皮肤和心肌移植排斥反应的影响。方法：通过体外T淋巴细胞转化实验和混合淋巴细胞反应（MLR）实验，观察CMS030在体外的免疫抑制作用，建立小鼠皮肤移植和心肌移植模型，观察CMS030对小鼠同种移植物存活时间的影响，观察CMS030对移植受体小鼠T淋巴细胞转化和脾细胞分泌IL2的影响。结果：CMS030在体外能够抑制T淋巴细胞转化和MLR，在体内可以明显延长小鼠皮肤移植物和心肌移植物存活时间，抑制皮肤移植受体小鼠T淋巴细胞转化能力和脾细胞分泌IL2水平。结论：CMS030通过抑制T淋巴细胞分泌IL2，抑制T淋巴细胞功能，有效拮抗移植排斥反应。

【关键词】  CMS030 皮肤移植 心肌移植 IL2

　　Study on the suppressive effects of CMS030 tetramer on allograft rejection in mice

　　ZHAO Lan，LU Rong，WANG Song，FU Zheng，LI QiuLi，WANG Li，L JunQiang，MA Rui，XU Qiong，YAO Zhi.

　　Department of Immunology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070，China

　　［Abstract］  ob[x]jective:To investigate the effects of CMS030 on skin and cardiac allograft rejection in mice.Methods:The effects of CMS030 in vitro were studied by ConA induced T cell proliferation and mixed lymphocyte reaction(MLR). The tail skin grafts of BALB/c mice were placed in wound bed on the back of C57BL/6 mice, and the cardiac allografts of newborn C57BL/6 mice were transplanted into the posterior of BALB/c mice.The effects of CMS030 on the survival time of the grafts were observed. ConAinduced lymphocyte proliferation and the IL2 of the mice were examined.Results:The inhibition effects of CMS030 on T cells were displayed in vitro and the survival time of grafts was significantly prolonged by CMS030 in vivo. ConAinduced lymphocyte proliferation and the IL2 secretion of the mice were both reduced by CMS030.Conclusion:CMS030 can inhibit IL2 secretion of T lymphocytes, and suppress allograft rejection efficiently.

    ［Key words］  CMS030；Skin transplantation；Cardiac transplantation；IL2
   
　　免疫抑制剂已经广泛用于器官移植排斥的治疗，迄今仍然是临床预防和治疗排斥反应的主要方法。然而，目前使用的免疫抑制剂还远没有达到高效和安全的要求，它们会降低患者的全身免疫功能，药物的也造成临床用药的极大局限，人们仍在寻找理想的免疫抑制剂。脾脏是机体的大免疫器官，也是活跃的免疫器官之一，含有丰富的细胞基本营养成分及细胞因子，特别是促进细胞代谢的能量中间体，如核酸、多肽类物质及寡核苷肽。国内外学者先后从动物脾脏中提取出了具有免疫活性的多肽，如IMEncap和spleen P.M.G等脾脏提取物，用于调节免疫和肿瘤的辅助治疗［1，2］。CMS030是脾脏提取的小分子四肽类化合物，由苯丙氨酰、谷氨酰、谷氨酰、甲硫氨酸组成。本研究探讨CMS030对淋巴细胞免疫功能的影响以及对同种移植排斥反应的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物及体内实验分组

　　C57BL/6J（H2b）小鼠和BALB/c（H2d）小鼠，5周龄，雌雄各半，军事医学科学院动物中心提供；C57BL/6J新生乳鼠，本教研室繁殖。皮肤移植和心肌移植受体小鼠各随机分为3组：CMS030剂量Ⅰ组〔10 μg/（kg·d）〕、CMS030剂量Ⅱ组〔2 μg/（kg·d）〕、生理盐水组（0.5 ml/天），药物腹腔注射，每日1次，连续给药5日后进行移植手术，术后持续给药20日。

　　1.2  主要试剂

　　CMS030由深圳康哲药业有限公司提供；胎牛血清（FBS）、RPMI1640为美国Hyclone公司产品；Hanks’液为美国Gibco公司产品；刀豆蛋白（ConA）、四甲基偶氮唑盐（MTT）为美国Sigma公司产品；丝裂霉素（MIT）为浙江海正药业股份有限公司生产；硫化钠由天津市北联精细化工有限公司生产；IL2检测ELISA试剂盒为R&D systems Inc产品。

　　1.3  体外T淋巴细胞转化实验

　　制备BALB/c小鼠脾细胞悬液，10%FBS的RPMI1640调整细胞浓度为4×106 ml-1，在96孔细胞培养板中每孔加入100 μl。阳性对照组加入100 μl ConA（终浓度为5 μg/ml），药物组加入100 μl CMS030（终浓度分别为40、8、1.6和0.32 μg/ml），阴性对照组加入100 μl RPMI1640。每孔总体积为200 μl，设6个平行孔。96孔板置于37℃、5%CO2培养箱中孵育72小时后，MTT法检测吸光度（OD），测定波长570 nm，参考波长630 nm。

　　1.4  体外混合淋巴细胞反应（MLR）实验

　　制备BALB/c小鼠脾细胞悬液，10%FBS的RPMI1640调整细胞浓度为8×106 ml-1，作为反应细胞。制备C57BL/6J小鼠脾细胞悬液，加入MIT（终浓度为25 μg/ml）孵育45分钟，洗涤后用10%FBS的RPMI1640调整细胞浓度为8×106 ml-1，作为刺激细胞。96孔板中，药物组和阳性对照组加入反应细胞和刺激细胞各100 μl，药物组中加入20 μl CMS030（浓度分别为40、8、1.6和0.32 μg/ml），阳性对照组中加入20 μl RPMI1640，阴性对照组中只加入200 μl刺激细胞和20 μl RPMI1640。每孔总体积220 μl，设6个平行孔。96孔板置于37℃、5%CO2培养箱中孵育5日，MTT法检测OD570值。

　　1.5  小鼠心肌移植实验

　　取BALB/c受体小鼠，在耳廓背侧中线下1/3处做一个3 mm横切口，从切口向耳尖方向钝性分离皮下组织，制成4 mm深的囊腔作为植床。取出新生C57BL/6J乳鼠心脏，置Hanks’液中排空心腔内余血，植入植床内，轻压囊腔上方的皮肤，排尽空气，使心肌与周围皮肤紧密接触。术后第6日开始，用心电图仪逐日检测移植心脏的心电图，连续3日无心电定为手术失败，不计入统计，心电消失定位排斥终点，记录移植物生存时间［3］。

　　1.6  小鼠皮肤移植实验

　　将C57BL/6J受体小鼠背部用8%硫化钠溶液脱毛，次日脱毛部位消毒后剪去1 cm×1 cm的皮片，创面经压迫止血后作为植床。取同性别BALB/c小鼠尾部皮肤作为移植物平铺于植床，用创可贴和医用胶布通过胸腹部环绕包扎，使皮片和植床紧密接触。术后第8日拆除包扎，逐日观察移植物颜色、硬度、结痂和脱落情况，以皮片变黑变硬，结痂脱落定为排斥终点，记录移植物生存时间［4］。

　　1.7  皮肤移植受体小鼠T淋巴细胞增殖实验

　　皮肤移植受体小鼠于给药结束后次日，无菌分离脾脏，分别制成脾细胞悬液，调整细胞浓度为4×106 ml-1，96孔板中每孔加入100 μl，ConA刺激组加入100 μl ConA（终浓度为5 μg/ml），对照组加入100 μl RPMI1640。每孔总体积200 μl，设4个平行孔。96孔板置37℃、5%CO2培养箱中孵育72小时，MTT法检测OD570值。

    刺激指数（SI）＝ConA刺激组OD值均数对照组OD值均数。

　　1.8  皮肤移植受体小鼠脾细胞分泌IL2实验

　　取皮肤移植小鼠脾细胞悬液，调整细胞浓度为2×106 ml-1，24孔板中每孔加入1.5 ml，加入ConA（终浓度为10 μg/ml）。孵育48小时离心后收集上清，ELISA试剂盒检测IL2浓度［5］。

　　1.9  统计方法

　　数据以x±s表示，采用KaplanMeier生存分析统计移植物生存时间，采用OneWayANOVA中的Student NewmanKeuls（SNK） 进行多组间数据比较。P<0.05确认为有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  CMS030体外对T淋巴细胞转化功能的影响

　　淋巴细胞转化实验是体外检测药物对淋巴细胞影响的常见方法，ConA能够特异性刺激T淋巴细胞形成淋巴母细胞而促进增殖，MTT法可以检测淋巴细胞的增殖程度。CMS030药物浓度为0.32～40 μg/ml时，在体外能够明显抑制ConA诱导的T淋巴细胞转化，与阴性对照组比较，P<0.01，见图1。

　　2.2  CMS030体外对MLR的影响

　　MLR是模拟真实体内细胞免疫反应的一种实验方法，可用于评价机体T细胞对组织相容性抗原的特异性免疫应答功能，提供器官移植的体外依据［6］。CMS030浓度为1.6～40 μg/ml时，在体外能够抑制小鼠混合淋巴细胞反应，与阴性对照组比较，P<0.01，见图2。

　　2.3  CMS030对小鼠心肌移植物生存时间的影响

　　BALB/c（H2d）和C57BL/6J（H2b）是遗传背景差异较大的两个近交系小鼠，在移植排斥反应的研究中，常用作受体和供体。小鼠尾背皮肤移植模型和耳后心肌移植模型是两个经典的移植免疫动物模型，其特点是方法简便、易操作，可以较直观地观察和检测排斥反应，常用于同种移植排斥免疫学机制和抗排斥药物的研究［7］。CMS030给药剂量10、2 μg/（kg·d）能延长小鼠心肌移植物平均生存时间，与生理盐水组比较，P<0.05，见图3。

　　2.4  CMS030对小鼠皮肤移植的影响
 
　　CMS030给药剂量10、2 μg/（kg·d）时能延长小鼠皮肤移植物平均生存时间，与生理盐水组比较，P<0.01，见图4。

　　2.5  CMS030对皮肤移植受体小鼠T淋巴细胞增殖的影响

　　细胞免疫应答在同种移植排斥反应中发挥主要作用，受体T细胞直接识别供者抗原提呈细胞表面的同种抗原，发生激活和增殖，CD4+T细胞介导的迟发型超敏反应性炎症，CD8+T细胞特异性杀伤移植物细胞。CMS030对ConA刺激的T淋巴细胞增殖有一定的抑制作用，与生理盐水组比较，P<0.01，见图5。

　　2.6  CMS030对皮肤移植受体小鼠脾细胞分泌IL2的影响

　　ConA可以诱导T细胞分泌IL2，IL2是T细胞的主要活化因子，主要由T细胞分泌，可以反映细胞免疫应答程度［8］。CMS030能够降低ConA诱导的小鼠脾细胞分泌IL2的水平，与生理盐水组比较，P<0.01，见图6。

　　3  讨论

    器官移植已成为治疗终末期疾病的主要手段之一，近30年来，器官移植的发展已取得令人瞩目的成绩，更为安全有效的免疫抑制剂的不断推出及临床应用起了重要作用，21世纪的器官移植领域依然是免疫抑制剂为主的时代［9］。特异性针对T细胞趋化、活化、分化等各个环节的免疫抑制剂是抗移植排斥药物研究的重要发展方向。多肽类药物可以特异性模拟或阻断蛋白质间相互作用，能够发挥特异性的免疫抑制作用，如小肽类药物Fuzeon可以抑制病毒与淋巴细胞的融合，已经用于治疗HIV。二肽化合物MDP是分枝杆菌细胞壁中具有免疫活性的小结构单位，能激活单核巨噬细胞、NK细胞，发挥杀伤肿瘤细胞的作用［10，11］。

    CMS030在体外能显著抑制ConA诱导的T淋巴细胞转化，提示CMS030能够抑制T淋巴细胞的非特异性增殖，是一种具有T淋巴细胞抑制作用的免疫活性药物。CMS030在体外MLR实验中显示较强的抑制T淋巴细胞增殖的作用，表明CMS030能够抑制特异性的T淋巴细胞功能，降低特异性抗原决定簇对T淋巴细胞的活化。体外实验提示，它可能对T细胞免疫功能和同种移植排斥反应有一定的抑制作用。在小鼠心肌移植和皮肤移植动物模型中，CMS030能够降低移植排斥反应对移植物的损害，延长小鼠皮肤移植物和心肌细胞的存活时间，表明CMS030在体内能够发挥抗移植排斥的作用。

    同种移植排斥发生机制以细胞免疫为主，移植物出现大量单个核细胞浸润（主要为T淋巴细胞），CD4+T细胞分泌IL2等细胞因子，促进CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖活化，CD4+T细胞介导超敏反应性炎症，CD8+T细胞发挥细胞毒性，使移植物受到排斥。本研究进一步观察CMS030对皮肤移植受体小鼠T淋巴细胞功能的影响，探讨CMS030在移植排斥反应中对机体细胞免疫水平的影响。CMS030能抑制受体鼠T淋巴细胞转化，表明CMS030可以使T淋巴细胞增殖功能下降，从而抑制机体细胞免疫应答能力，减轻移植排斥对移植物的损伤。移植排斥细胞免疫应答过程中，IL2是启动移植排斥反应的关键细胞因子，可以直接反映细胞免疫应答程度，观察体液IL2水平和T淋巴细胞IL2诱生实验是监测机体排斥反应的重要指标［12］。

　　CMS030能抑制ConA诱导的T淋巴细胞分泌的IL2水平，表明CMS030可以通过抑制IL2的表达，降低T淋巴细胞成熟和活化的程度。实验结果表明，CMS030可以减少淋巴细胞分泌IL2，降低机体细胞免疫功能，发挥对移植排斥反应的治疗作用。在本研究过程中，CMS030用药组小鼠未发现有体重下降、行动迟缓等药物副作用的表现，而在传统免疫抑制剂的临床应用中，主要阻碍之一是药物的，如CsA存在肝肾毒性，FK506具有肾毒性和神经毒性等［13，14］。因此，CMS030是一种有前途的抗移植排斥新药，有望替代或部分替代正在使用的免疫抑制剂。

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作者：赵岚 陆融 王松傅正 李秋丽 王莉 吕军强 马睿 徐琼 姚智

作者单位：天津医科大学免疫学教研室，天津 300070