光气染毒小鼠急性肺损伤的浓时积与效应关系研究

【摘要】  目的 通过比较光气染毒浓时积(Ct)的两个参数(浓度C与时间t)对染毒小鼠急性肺损伤程度的影响，探讨光气导致急性肺损伤的机制。方法 以不同浓时积和固定浓时积不同浓度与时间进行光气染毒，测定肺脏湿干比、丙二醛(MDA)含量和髓过氧化物酶活力以及血清中MDA含量。结果 随染毒浓时积增加，小鼠中毒死亡率增加(P＜0.001)；浓时积固定为12 ml·min时，染毒浓度增加，小鼠中毒死亡率增加(P＜0.01)，肺湿干比增加(P＜0.001)，肺脏髓过氧化物酶活力和MDA浓度升高(P＜0.05)。结论 光气染毒随浓时积增加，动物中毒死亡率升高，但在浓时积相同的条件下，暴露毒剂的浓度与暴露时间对急性中毒的影响不同；暴露毒剂的浓度高低对中毒程度的影响远大于暴露时间的影响，短时间高浓度的光气吸入会比低浓度长时间的光气吸入造成更为严重的肺部损伤。

【关键词】  光气； 肺水肿

　　Study on the Cteffect relation of acute lung injury induced by phosgene in mice

　　XI Qingxiang, HAI Chunxu, WANG Peng, LIU Rui, YANG Xuekang, YU Yang, GAO Zhiqing.

　　Department of Toxicology, Faculty of Military Preventive Medicine, Fourth Military Medical University, Xi'an  710032, China

　　【Abstract】ob[x]jective　By comparing with the effects of two parameters (exposure concentration and exposure time) of concentration × time(Ct) product on degree of acute lung injury of mice induced by phosgene, to study the mechanism of acute lung injury induced by phosgene. Methods  The mice were respectively exposed to phosgene under the different Ct product and the same Ct product but different exposure concentrations and exposure times. The wet/dry radio of lung, the enzyme activity of MPO in lung and the content of malondialdehyde (MDA) in lung and serum were detected. Results With Ct product increasing, death rate of mice increased significantly (P＜0.001). Under the same Ct product of 12 ml·min, death rate increased significantly (P＜0.01) by the exposure concentration. The wet/dry radio of lung increased significantly (P＜0.001). The enzyme activity of MPO and the content of MDA in lung were both higher than that of the control (P＜0.05). Conclusions With Ct products increasing, death rate of mice exposed to phosgene increased. However, under the same Ct product, exposure concentration and exposure time had different effects on degree of lung injury. It was found that exposure concentration affected degree of lung injury much more than exposure time. Exposure to high concentration of phosgene for short time would induce more severe lung injury than that to low concentration of phosgene for long time.

　　【Key words】Phosgene; Pulmonary edema
(Chin J Dis Control Prev 2007，11(2)：160163)

　　光气是一种窒息性气体，也是重要的化工原料，广泛应用于高分子材料、农药、医药、香料和染料等领域，作为军用毒剂，联合国裁军委员会将光气定位为“双用途毒剂”。光气损伤的主要靶器官是肺脏，可导致肺水肿，甚至急性呼吸性窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，中毒者常因为窒息和心衰而死亡［1～3］。由于光气中毒机理不清楚，因而光气成为军用战剂中为“难防、难治”的化学武器，至今尚无的防治方法。有报道表明：光气吸入后导致的肺损伤，有中性粒细胞在肺部大量聚集和扣押存在，扣押在肺内的中性粒细胞被炎症因子激活，引发呼吸爆发，产生大量自由基，从而对肺脏乃至全身造成氧化损伤［4］。通过笔者所在实验室的长期努力，对光气中毒机制、药物防治措施的研究取得了一定进展。研究表明，光气中毒程度在染毒浓时积一定的情况下，可能依暴露时间和暴露浓度的不同而呈现不同的变化，而这些变化可能会产生不同的中毒机制以及造成中毒死亡率的差异，因而也会对治疗方法提出不同的要求。为证实这些推论的正确性，本实验在探讨了不同浓时积光气染毒对小鼠中毒死亡率影响的基础上，以固定浓时积、变化染毒浓度与时间进行光气染毒，观察肺脏氧化应激相关指标如髓过氧化物酶活力、丙二醛(malondiadehyde,MDA)水平，以及肺脏湿干比等变化，以进一步探讨光气损伤的机制。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料

　　仪器：752型分光光度计，上海医用仪器厂；970 CRT荧光分光光度计，上海三科仪器有限公司生产；半动态气体染毒柜由本教研室自行设计。

　　试剂：MDA标准品为E.Merck产品，硫代巴比妥酸为Sigma产品，正丁醇为天津市科密欧化学试剂开发中心产品，髓过氧化物酶活力测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，小牛血清白蛋白、磷钨酸购于上海生物化学试剂进出口公司。

　　光气：由固体光气有机碱滴定发生法产生，光气由40%固体光气溶液在N,N二甲基甲酰胺的滴定下产生，固体光气由润发化工有限公司生产。

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物分组

　　昆明种小鼠100只，雌雄各半，体重20.8～21.3 g，由第四军医大学实验动物中心提供，随机分为3个浓时积(Ct)组和一个阴性对照组，每个浓时积组30只，分别为Ct=12 ml·min组、Ct=15 ml·min组和Ct=18.2 ml·min组，阴性对照组10只；然后按相同浓时积，不同染毒浓度与时间，将每个浓时积组再随机分为3组，每组10只，其中：Ct=12 ml·min组：12 ml×1 min组、4 ml×3 min组、2.4 ml×5 min组；Ct=15 ml·min组：15 ml×1 min组、5 ml×3 min组、3 ml×5 min组；Ct=18.2 ml·min组：18.2 ml×1 min组、6.1 ml×3 min组、3.6 ml×5 min组。

　　另取昆明种小鼠40只，体重20.2～21.4 g，随机分为阴性对照组和3个实验组(2.4 ml×5 min组、4 ml×3 min组、12 ml×1 min组)，每组10只。实验组为相同浓时积(Ct=12 ml·min)不同染毒浓度和时间。

　　1.2.2  动物染毒

　　批100只昆明种小鼠，染毒前正常饮水、进食，按上述分组标识给予染毒浓度和染毒时间剂量染毒，阴性对照组小鼠用空气作为对照，染毒后正常饮水、进食，观察7天，记录中毒死亡动物数，计算中毒死亡率。第二批40只昆明种小鼠，按相同的浓时积(Ct=12 ml·min)、不同的染毒浓度，将三组小鼠按2.4 ml×5 min、4 ml×3 min、12 ml×1 min用光气染毒，阴性对照组小鼠用空气作为对照，染毒后5 h处死，摘眼球取血，开胸取肺，测定相关指标。

　　1.2.3  指标测定

　　第1批100只昆明种小鼠染毒后正常饮水、进食，观察7 d，记录中毒死亡率。第2批40只昆明种小鼠染毒后5 h，摘眼球取血，分离血清，测定其MDA含量。开胸取肺脏，右半肺液氮冻存，左半肺放入小瓶皿中称湿重(除去每只瓶皿重量)，放入烤箱中，在80 ℃下烘烤72 h至恒重，称干重(除去每只瓶皿重量)，计算湿干比。右半肺加生理盐水制成1∶5的匀浆液，3 000 r／min离心10 min，取上清测定MDA含量。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸荧光法，MPO活力应用试剂盒测定，蛋白定量采用Lowry's法。

　　1.2.4 统计分析

　　数据以±s表示，用SPSS 11.0统计软件进行分析；小鼠染毒后中毒死亡率的比较应用χ2检验，其余采用完全随机设计资料的方差分析进行组间比较。

　　2  结果

　　2.1 不同染毒剂量小鼠中毒死亡率比较

　　光气染毒浓时积不同，小鼠的中毒死亡率差异有统计学意义(χ2=16.121，P＜0.001)，且随染毒浓时积增加，小鼠的中毒死亡率有增加的趋势(表1)；在相同浓时积条件下，光气染毒浓度不同，小鼠的中毒死亡率差异也有统计学意义(χ212 ml·min =11.553，P12 ml·min＜0.01；χ215 ml·min=23.333，P15 ml·min＜0.001；χ218.2 ml·min=6.477，P18.2 ml·min＜0.05)，随染毒浓度增加，小鼠的中毒死亡率有增加的趋势(表2)。阴性对照组小鼠，未见死亡。表1 染毒浓时积(Ct)对小鼠中毒死亡率的影响（略）表2 染毒浓度对小鼠中毒死亡率的影响（略）

　　2.2 小鼠肺湿干比

　　12 ml×1 min组小鼠肺脏湿干比(7.33±1.68)与对照组(3.44±0.59)差异有统计学意义(P＜0.001)，与2.4 ml×5 min组(4.71±0.65)、4 ml×3 min组(5.03±1.175)比较，肺脏湿干比差异也有统计学意义(P＜0.01)，表明相同浓时积，染毒浓度越大，肺水肿越明显。见表3。表3  ……相同浓时积(Ct=12 ml·min)不同染毒浓度和时间对小鼠肺脏湿干比、髓过氧化物酶活力、MDA浓度及血清MDA浓度的影响（略）

　　2.3  小鼠肺脏髓过氧化物酶活力

　　12 ml×1 min组小鼠肺脏髓过氧化物酶活力(1.74±0.54)与对照组(1.19±0.10)差异有统计学意义(P＜0.01)，与2.4 ml×5 min组(1.32±0.26)比较，差异也有统计学意义(P＜0.05),由此表明，在相同浓时积条件下，染毒浓度越大，肺脏髓过氧化物酶活力越强。见表3。

　　2.4  小鼠肺脏MDA浓度

　　12 ml×1 min组小鼠肺脏MDA浓度(477.80±57.90 nmol/g pr)与对照组(363.33±37.01 nmol/g pr)差异有统计学意义(P＜0.01)。4 ml×3 min组肺脏MDA浓度(443.14±47.85)与对照组差异有统计学意义(P＜0.05)。同时12 ml×1 min组与2.4 ml×5 min组(375.68±89.07)比较，差异也有统计学意义(P＜0.05)，说明在相同浓时积条件下，染毒浓度越大，肺脏MDA浓度越高。见表3。

　　2.5 小鼠血清MDA浓度

　　小鼠血清中MDA含量组间差异无统计学意义。见表3。

　　3  讨论

　　通常蒸气、烟、雾通过呼吸道吸收引起伤害的剂量指标用浓度×暴露时间，即浓时积表示。在一定范围内，毒剂引起呼吸道损害的程度与浓时积是成正相关的，而根据我们以往的光气染毒实验发现光气中毒程度在染毒浓时积一定的情况下，可依暴露时间和暴露浓度的不同而呈现不同的变化,特别是动物的中毒死亡率与染毒光气浓度的关系更大，为进一步证实此发现笔者设计了本次实验。

　　对于光气所致的急性肺水肿模型［5］，国际上主要以肺湿/干比值作为判定指标，本实验染毒动物的肺湿/干比值均高于阴性对照组，表明成功复制了光气所致的急性肺损伤模型。在此基础上，我们继续对不同剂量条件下的染毒小鼠肺损伤情况进行研究，发现随着染毒气体浓度的增加肺损伤程度在加重。从染毒小鼠的中毒死亡率上看，随着染毒浓时积的增加，小鼠中毒死亡率增加。在染毒光气浓时积一定时，高浓度染毒组的死亡率也高于低浓度组。从肺水肿的指标上看，高浓度染毒组肺湿干比不仅和对照组比较有增加而且也高于两个较低浓度染毒组。在大多数情况下，急性肺损伤表现为中性粒细胞依赖性，中性粒细胞在各种炎性因子的刺激下活化，在肺部扣押并释放各种介质如活性氧、弹性蛋白酶、髓过氧化物酶等，造成急性肺损伤［6～8］。实验中发现，固定浓时积时，高浓度染毒组肺脏髓过氧化物酶活力与低浓度染毒组相比升高，说明光气肺损伤不仅有中性粒细胞肺内扣押的存在且其程度与染毒浓度有关。研究表明中性粒细胞发生呼吸爆发，能够释放大量的自由基和活性氧，这些物质均可导致链式脂质过氧化反应从而损伤细胞膜［9］。MDA是脂类过氧化的主要产物之一，常作为反映生物体内氧化损伤比较灵敏、可靠的标志物［10］。从本实验中小鼠肺脏的MDA含量来看，高浓度染毒组肺脏MDA含量与低浓度染毒组比较增加，说明高浓度组肺脏的氧化损伤加重，这些都与中毒死亡率趋势相一致，由此可以看出，光气中毒有着复杂的损伤机制。
 
　　由于光气挥发点低，易于水解的特性，它水解后的产物大多属于强氧化性和强酸性物质如次氯酸和盐酸等，这些物质如果在短时间内高浓度地进入气道，就会产生强烈的酸性烧伤作用和氧化作用，面对如此快速强烈的损伤，机体已来不及启动应激保护机制，终发生了级链式的炎症损伤反应，同时由于光气难溶于水的特性使其更容易进入深层气道，也加重了肺脏的损伤；而在固定浓时积条件下，较长时间低浓度的光气吸入，由于其浓度较低，酸烧伤和氧化作用减弱，再加上肺泡腔内分泌液的稀释作用，使得光气的直接损伤作用变得不明显，而且即便吸入时间较长，由于机体的应激保护机制作用也使得这种已被减弱的损伤达不到级链放大的效应。由此表明在浓度与时间乘积的“浓时积”构成中，两者对于造成肺损伤的影响并不是均衡的，其中的染毒浓度对于肺损伤的影响高于时间的影响。同时本实验还发现，血清中MDA含量各组差异都没统计学意义，这与以往研究所发现的光气急性吸入可造成全身活性氧水平升高［11］的结论不一致，其具体原因还有待于进一步实验研究。

　　本实验结果显示，光气的确对肺脏造成了严重的损伤，并且其损伤程度不仅与染毒浓时积有关，更与吸入光气的直接浓度有着密切的关系，短时间高浓度的光气吸入会比低浓度长时间的光气吸入造成更为严重的肺部损伤。提示，对于速效性毒剂染毒动物，用浓时积表示干预权重具有一定局限性，直接以用单位时间内的染毒浓度也许更能代表染毒干预权重，或者说染毒浓度与损伤效应成正相关。

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　　［5］刘瑞,海春旭,王鹏,等. 光气急性中毒的剂量反应关系与肺水肿动物模型的建立 ［J］. 疾病控制杂志, 2005,9(5):419421.

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　　［10］李文丽,海春旭,刘瑞,等. 光气染毒造成小鼠肺脏的氧化损伤 ［J］. 疾病控制杂志, 2004,8(6):554556.

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作者：席庆祥， 海春旭， 王鹏， 刘瑞， 杨薛康， 于洋， 高志清

作者单位：第四军医大学军事预防医学系毒理学教研室， 陕西 西安710032