南瓜蛋白与STI571体外联合抗K562细胞的作用

作者：孙建成, 谢捷明, 张昆仲, 黄自强, 陈明晃

作者单位：福建医科大学 药学院, 福州 350004

【摘要】  目的 探讨南瓜蛋白与STI571对K562细胞增殖的抑制作用及其机制。 方法 用MTT检测南瓜蛋白与STI571单用或联合作用对K562细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测药物对细胞的凋亡率;Western blot检测药物对p210Bcr-Abl蛋白的影响。 结果 南瓜蛋白与STI571联合作用协同抑制K562细胞增殖(q>1.15);协同诱导K562细胞凋亡;协同抑制p210Bcr-Abl蛋白表达。 结论 南瓜蛋白与STI571联合作用体外协同抗K562细胞的增殖。

【关键词】  南瓜; K562细胞; 植物蛋白类; 受体蛋白质酪氨酸激酶类; 细胞增殖

    The Effect of Cucurmosin and STI571 on K562 Cell Growth in vitro

    SUN Jiancheng1, XIE Jieming1, ZHANG Kunzhong1, HUANG Ziqiang1, CHEN Minhuang2

    1.School of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China

    2.Fujian Institute of Research on the Structure of Matter, Chinese Academy of Sciences,

    State Key Laboratory Chemistry, Fuzhou 3500002, China

    ABSTRACT:  ob[x]jective  To investigate the effect and mechanism of cucurmosin and STI571 on K562 cell growth.  Methods  MTT was used to evaluate the growth inhibitory effect of cucurmosin and STI571.FCM was used to detect the apoptotic rate induced by cucurmosin and STI571.  Western blot was used to investigate the effect of p210Bcr-Abl induced by cucurmosin and STI571.  Results  Cucurmosin and STI571 exerted a synergistic inhibitory effect on K562 cell growth(q>1.15).  FCM showed that cucurmosin and STI571 also exerted a synergistic apoptotic effect on K562 cells(q>1.15).  Western blot indicated cucurmosin and STI571 synergistically inhibited the ex[x]pression of p210Bcr-Abl.  Conclusion  Cucurmosin enhances STI571 in inhibition of K562 cell growth.

    KEY WORDS:  Cucurmobita moschata; K562 cells; plant proteins; receptor protein-tyrosine kinases; cell proliferation

    南瓜蛋白(cucurmosin)是从南瓜瓤中提取的I型核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP),相对分子质量约27 kD,为碱性单肽链糖蛋白,具有抗肿瘤和促分化作用［1-4］。STI571(Gleevec,CGP57148B,imatinib mesylate)是Bcr/Abl融合蛋白酪氨酸激酶( protein tyrosine kinase,PTK)活性的竞争性抑制剂,临床上用于治疗Bcr/Abl表达阳性的慢性粒细胞白血病(CML)和急性淋巴细胞白血病(ALL),疗效显著［5-6］。笔者探讨南瓜蛋白与STI571联合抗K562细胞的作用及其机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  药品与试剂  南瓜蛋白由本课题组制备,纯度>95%。STI571(瑞士诺华公司)经萃取、重结晶所得,纯度达99%,溶解于DMSO中,配成10 mmol/L,于-20 ℃储存备用。抗c-Abl抗体(美国Santa Cruz公司)。

    1.1.2  细胞株及培养条件  人慢性粒细胞白血病细胞株K562(中国科学院上海细胞研究所),培养于含10%小牛血清、1×108 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液,在37 ℃、体积分数为0.05的CO2条件下培养。细胞接种24 h后进入指数增长期。

    1.2  方法

    1.2.1  南瓜蛋白单独或联合STI571对K562细胞的抑制作用  K562细胞悬液200 μL［(2～4)×109 L-1］,加入96孔板中,分别设空白组、不同浓度药物组及加等量溶剂阴性对照组,每个浓度重复4孔,无细胞孔为背景,各孔终体积相同。将培养板置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱培养48 h,以MTT法测定联合用药对细胞增殖的抑制作用。

    1.2.2  南瓜蛋白联合STI571诱导K562细胞凋亡的作用  收集药物处理的细胞,根据凋亡检测试剂说明书操作;流式细胞仪(FCM)分析凋亡细胞百分率(sub-G1%)。

    1.2.3  Western blot检测K562细胞p210Bcr-Abl蛋白表达  收集单用或联用药物处理的细胞,根据分子克隆实验指南［10］,提取细胞质总蛋白,经SDS-PAGE电泳分离,转膜,封闭和印迹。一抗为抗c-Abl单抗,二抗为碱性磷酸酶交联的抗体。

    1.3  统计学处理  评价药物合用对体外细胞毒有无协同作用,参照文献［11-12］,以金氏公式判断合并用药效果:

    q=Ea+b/(Ea+Eb-Eab)

    Ea+b:合并用药抑制率; Ea,Eb:A药和B药的抑制率;分子代表“实测合并效应”;分母是“期望合并效应”,q:两者之比。q值0.85～1.15为单纯相加(+),1.15～2.0为增强(),>2.0为明显增强(),0.85～0.55为拮抗(-),<0.55为明显拮抗(--)。

    2  结  果

    2.1  南瓜蛋白联合STI571对K562细胞抑制的协同作用  单用南瓜蛋白0.625,1.25,2.5μg/mL作用48 h,对K562细胞抑制率为12.56%,21.59%和43.08%;单用STI571 0.05,0.1,0.2 μmol/L作用48 h,对K562细胞的抑制率为18.47%,34.89%和53.01%,而不同浓度南瓜蛋白与STI571合用的抑制率均大于两药相应浓度单用的抑制率,绝大多数联合用药组合q>1.15,表明两药合用对K562细胞体外杀伤有协同作用(表1)。表1  南瓜蛋白与STI571联合作用抗K562细胞的作用

    2.2  南瓜蛋白联合STI571诱导K562细胞凋亡的协同作用  南瓜蛋白 1.25 μg/mL作用48 h,K562细胞凋亡率20.4%,STI571 0.2 μmol/L作用48 h,凋亡率26.5%,两药合用凋亡率上升到60.2%,经分析q值1.45(>1.15),说明两药具有协同促凋亡作用(图1,表2)。表2  FCM检测南瓜蛋白与STI571诱导K562细胞凋亡的百分率

    2.3  南瓜蛋白联合STI571对K562细胞p210Bcr-Abl的影响  单独0.2 μmol/L STI571作用48 h,p210Bcr-Abl含量变化不明显,而单独用1.25 μg/mL 南瓜蛋白作用48 h,K562细胞p210Bcr-Abl蛋白含量减少,而两药合用减少明显,说明两药合用对K562细胞p210Bcr-Abl蛋白含量影响起协同作用(图2)。

    3  讨  论

    STI571是Bcr/Abl融合蛋白酪氨酸激酶(TK)活性的竞争性抑制剂,在治疗Ph阳性的慢性粒细胞白血病方面具有独特的作用机制和高效的特异性［5-6］。体外实验表明,STI571可抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡［7-9］。

    核糖体失活蛋白(RIP)广泛存在于高等植物中,按照结构可分为I型和Ⅱ型RIP［13］,具有抗生育、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学活性［14-16］。南瓜蛋白属于I型核糖体失活蛋白,本课题组前期研究表明,它具有抗肿瘤和促分化作用［1-4］ 。

    不论是MTT法测定药物体外杀伤作用,还是以诱导细胞凋亡为指标,南瓜蛋白与STI571在体外均有相加或增强作用,绝大多数联合用药组的q>1.15,表明二者的协同主要表现为协同作用。由于STI571主要针对蛋白酪氨酸激酶的抑制作用,对p210Bcr-Abl蛋白含量影响较少［17-18］,本实验结果与之一致；而南瓜蛋白则不同,从本实验结果看,南瓜蛋白单独作用可抑制p210Bcr-Abl的蛋白含量。因此南瓜蛋白可下调K562细胞p210Bcr-Abl蛋白水平,提示两药通过不同方式对K562细胞p210Bcr-Abl的TK活性及含量产生作用。通常两药呈现协同作用往往是因为二者具有不同的作用机制。笔者认为,南瓜蛋白可能是通过其核糖体失活作用,从而影响蛋白质表达,引起蛋白含量减少,但是有关机制需进一步证实。从目前结果分析,南瓜蛋白影响p210Bcr-Abl的含量,从而进一步影响了p210Bcr-Abl的蛋白酪氨酸激酶及其下游信号分子传递,终协同抑制K562细胞增殖。

    南瓜蛋白与STI571具有协同抑制K562细胞的增殖作用,这种作用与南瓜蛋白影响p210Bcr-Abl表达的机制有待进一步研究。

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