糖化终末产物受体在大鼠胰腺星形细胞中的表达

作者：李晓永，张洪梅，董艳，葛勤敏，陈寒蓓，刘继红,代伶俐,周亚琴,苏青

作者单位：上海交通大学医学院附属新华医院内分泌科，上海 200092

【摘要】  　　目的 研究胰腺星形细胞（PSCs）是否表达糖化终末产物受体（RAGE），并探讨糖化终末产物（AGEs）对RAGE表达的调节作用。方法 分离培养SD大鼠PSCs,采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学检测静息和活化的PSCs RAGE在mRNA和蛋白水平的表达,同时用RT-PCR检测AGEs刺激后RAGE表达的变化。结果 静息和活化的PSCs均表达RAGE，且活化后表达水平提高；AGEs能上调RAGE的表达。结论 静息和活化的PSCs均表达RAGE，活化的PSCs RAGE表达上调，提示PSCs是AGEs作用的靶细胞。

【关键词】  胰腺星形细胞；糖化终末产物受体；纤维化

　　ex[x]pression of receptor for advanced glycation end products in pancreatic stellate cells of rats

　　LI Xiao-yong,ZHANG Hong-mei,DONG Yan,et al

　　（Department of Endocrinology，the Affiliated Hospital of Xinhua,Medicine College of Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200092,China）
   
　　Abstract:  ob[x]jective  To investigate the ex[x]pression of the receptor for advanced glycation end-produts(RAGE) in pancreatic stellate cells（PSCs）and to explore the role of advanced glycation end-produts(AGEs) in its ex[x]pression.Methods  Rat PSCs were isolated from normal rat pancreas.ex[x]pression of RAGE was detected at mRNA and protein levels by semi-quantitative reverse transc[x]ription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and immunocytochemistry.Then RAGE mRNA level was analyzed by RT-PCR after AGEs stimulation．Results  Both the quiescent and activated PSCs expressed RAGE,and RAGE ex[x]pression was much higher in activated cells than that in quiescent cells.In addition,cultured PSCs could increase ex[x]pression of RAGE mRNA when exposed to AGEs.Conclusion  Both the quiescent and activated PSCs express RAGE and PSCs RAGE can upregulate its ex[x]pression,it indicates that PSCs is an important target of AGEs.
   
　　Key words:  pancreatic stellate cells;receptor for advanced glycation end-produts；fibrosis
  
　　大量研究表明糖尿病动物模型和糖尿病患者的内外分泌胰腺都存在着广泛的纤维化和功能异常［1-6］。由于胰腺星形细胞（pancreatic stellate cells,PSCs）的增殖和激活是胰腺细胞外基质（extracellular matrix,ECM）形成的主要原因［7］，而且在2型糖尿病（T2DM）动物模型，随着糖尿病的进展，常伴随胰腺纤维化区PSCs的激活［1，3，5］，因此糖尿病时胰腺纤维化也可能和PSCs激活有关。有研究表明糖化终末产物（advanced glycation end produts,AGEs）通过其特异性受体（receptor for AGEs,RAGE）诱导肾小球系膜细胞和腹膜间皮细胞的转分化(transdifferentiation)和ECM的合成,从而促进这些部位纤维化的发生和发展［8-9］。对于PSCs是否也是AGEs的靶目标国内外尚无报道，故本实验将研究PSCs是否表达RAGE受体，同时探讨AGEs对其自身受体表达的调节作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物  雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2003-0003,饲养于上海交通大学医学院附属新华医院实验动物中心。大鼠饲养2个月后，体质量300～400 g时用于实验。分离细胞前12 h禁食，自由饮水。

　　1.2  主要仪器及试剂  DMEM低糖培养基、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）和牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)购自美国Gibco公司；D-葡萄糖购自上海华舜生物工程有限公司；胶原酶IV、DNase I，链霉蛋白酶E和Nycodenz购自美国Sigma公司；兔抗大鼠RAGE受体多克隆抗体购自英国Abcam公司；HRP标记山羊抗兔二抗和DAB酶底物显色试剂盒购自上海长岛生物技术有限公司；二步法RT-PCR试剂盒购自美国invitrogen公司；HF90/HF240型CO2培养箱(上海力康发展有限公司)；PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)，凝胶紫外成像仪(英国Syngene公司)；F- 4500荧光分光光度计（日本Hitachi公司）；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

　　1.3  AGEs-BSA的制备和鉴定  参考文献［10-11］制备和纯化AGEs:准确称取0.5 g BSA溶解于10 mL pH 7.4、0.2 mol·L-1的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)中，然后加入0.9 g D-葡萄糖，待其溶解后，0.22 μm针头滤器抽滤除菌,37 ℃避光孵育120 d取出,将之置于透析袋中透析24 h,每3 h换透析液充分除去未结合的葡萄糖，后得到棕黄色的AGEs-BSA。用相同的方法去除D-葡萄糖制备非糖化BSA作为对照。制备的AGEs-BSA用AGEs荧光光谱扫描后发现其激发高峰位于360 nm,发射高峰位于446 nm，证实BSA已转化为相应的AGEs。

　　1.4  PSCs的分离、培养及处理  按参考文献［12］方法分离PSCs，并略作改进。步骤简述如下：选体质量300～400 g的SD大鼠戊巴比妥钠(30 g·L-1)麻醉后，无菌条件下剖腹，结扎胆总管近端，采用顺行胆管插管法将适量37 ℃预温的酶消化液（含12.5 U胶原酶IV、21 U链酶蛋白酶、5 000 U DNaseI，用D-Hanks配）注入胆总管内后，迅速分离胰腺并去掉周围脂肪组织，将胰腺剪碎置于上述酶消化液中37 ℃充分消化，待胰腺呈现泥沙状时终止并用200目钢网过滤，滤液用120 g·L-1Nycodenz不连续密度梯度离心分离PSCs。荧光显微镜鉴定细胞纯度为85%～90%，台盼蓝拒染实验检测细胞活力为96%。初分离的PSCs培养于含体积分数20%FBS、100 U·mL-1青霉素和100 mg·mL-1链霉素的低糖DMEM培养基中。细胞种植后24 h换液，此后2 d换液1次，当细胞达80%～90%融合后用含乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)的胰酶消化传代培养。选用第2代细胞为研究对象，研究AGEs对其受体表达的影响。具体处理如下：当第2代细胞达70%～80%融合时，用含体积分数0.1%FBS的DMEM培养24 h使细胞处于静息状态，弃培养基后各孔加入含0 mg·L-1及50 mg·L-1 AGEs的培养基和含50 mg·L-1 BSA的培养基(对照组)继续培养24 h，每组设4个复孔，收集刺激24 h后的细胞。

　　1.5  免疫细胞化学检测PSCs RAGE受体的表达  将初分离的PSCs种植于含有盖玻片的六孔板内，取培养3 d（静息细胞）和培养14 d（活化细胞）的细胞爬片用PBS清洗2遍,以去除培养液及胎牛血清，室温下用40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，30 g·L-1BSA封闭10 min，滴加兔抗大鼠RAGE多抗(1300)，湿盒内4 ℃过夜；PBS清洗2遍，滤纸吸干后滴加HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，室温放置1 h；PBS清洗2遍后DAB显色；用苏木素衬染细胞核，逐级脱水后，中性树胶封片。PBS 代替一抗做阴性对照，棕黄色染色为阳性。

　　1.6  逆转录聚合酶链法检测PSCs RAGE mRNA的表达  分别收集原代培养3 d（静息细胞）、培养14 d（活化细胞）及AGEs刺激24 h后的细胞，用TRIzol试剂一步法提取总RNA，经紫外分光光度法定量后，按照美国Invitrogen公司逆转录试剂盒说明，以Oligo(dT)为引物合成cDNA。用Premier5.0设计RAGE及管家基因GAPDH引物。RAGE正向引物：5′-CAGGGTCACAGAAACCGG-3′；反向引物:5′-ATTCAGCTCTGCACG TTCCT-3′，产物214 bp，退火温度60 ℃；GAPDH正向引物：5′-AAGAAGGTGG TGAAGCAGGC-3′;反向引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，产物300 bp，退火温度56 ℃。各样品目的基因和管家基因分别进行逆转录聚合酶链反应，产物用10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳后，Smart View凝胶分析程序分析目的基因和内参照GAPDH之间的灰度比值，此即为样品基因校正后的相对表达量。

　　1.7  统计学处理  采用SPSS 10.0软件包进行统计分析。所有实验数据用x±s表示，组间差异采用t检验。P<0.05表明有统计学差异。

　　2  结果

　　2.1  RAGE受体在静息和活化的PSCs上的表达  经细胞免疫染色发现培养3 d和14 d的PSCs都表达RAGE受体，阳性表达产物为棕黄色（图1A，图1B）,阴性对照细胞内未见棕黄色阳性颗粒(图1C,图1D)，而且发现活化的PSCs棕色颗粒较培养3 d的PSCs着色为深。半定量逆转录聚合酶链反应也发现活化的PSCs在mRNA水平较静息的PSCs增加(2.1±0.13)倍（P<0.05），见图2。

　　图1  RAGE在PSCs中表达的免疫细胞化学染色检测  (SP染色  ×200)（略）

　　A、C：原代培养3 d的静息PSCs  B、D：原代培养14 d的激活PSCs

　　Fig.1  ex[x]pression of RAGE protein in PSCS by immmunocytochemical staining  (SP staining  ×200)

　　A,C:3 d primary culture quiescent PSCs;B,D:14 d primary culture activated PSCs

　　2.2  AGEs对活化的PSCs RAGE mRNA表达水平的影响  传代培养的大鼠PSCs在AGEs刺激24 h后RAGE mRNA表达水平较同浓度BSA刺激组高(1.58±0.03)倍（P<0.05），比无刺激的对照组高(1.50±0.02)倍（P<0.05）,而BSA组和对照组之间没有统计学差异(P>0.05),见图3。

　　图2  原代培养3 d（静息）与原代培养14 d（激活）的PSCs RAGE mRNA 条带灰度的相对值  (aP<0.01)（略）

　　Fig.2  Relative value of absorption of RAGE mRNA band in 3d primary culture quiescent PSCs and 14 d primary culture activated PSCs  (aP<0.01)

　　图3  正常对照组、50 mg·L-1 BSA 及50 mg·L-1 AGEs处理后PSCs RAGE mRNA 条带灰度的相度值（略）

　　1:0 mg·L-1 AGEs;2:50 mg·L-1 BSA;3:50 mg·L-1 AGEs

　　Fig.3  Relative value of absorption of RAGE mRNA band in normal control group、50 mg·L-1 BSA group and experimental PSCs group treated by 50 mg·L-1 AGEs

　　1:0 mg·L-1 AGEs;2:50 mg·L-1 BSA;3:50 mg·L-1 AGEs

　　3  讨论
   
　　PSCs是位于胰腺小叶间和腺泡周围的间质细胞，胰岛内不存在。正常情况下其呈静息状态，仅合成少量的Ⅲ型胶原等ECM成分,因此其功能可能与维持胰腺的正常组织结构有关。当PSCs离体培养或胰腺发生损伤时，其可被激活，激活后的PSCs转分化为肌成纤维细胞样细胞（myofibroblast-like cells），该表型可具有高度自我增殖能力，并能合成和分泌大量Ⅰ型、Ⅲ型胶原等多种ECM成分［13］。有研究表明，PSCs可能是胰腺ECM蛋白的主要来源,在慢性胰腺炎纤维化形成中起着关键作用［7］。Kawano等［14］发现在T2DM模型OLETF(otsuka long-evans tokushima fatty)大鼠，随着鼠龄的增加胰岛出现进行性纤维化：20周龄以后的胰岛纤维化和增大非常明显，胰岛被结缔组织分割成小簇状，40周龄以后部分胰岛便被结缔组织取代。Yoshikawa等［1］除观察到与之相似的胰岛纤维化改变外，尚发现结缔组织增生从胰岛周围的间质向邻近的外分泌腺延伸，后观察到胰腺的广泛萎缩和结缔组织增生。Zhao等［4］以235个中国T2DM患者为研究对象通过病理活检发现，随着糖尿病的发展，57.9%的患者出现胰腺的弥漫性纤维化，其中有7.7%的患者胰腺间质出现增宽的结缔组织。在OLETF大鼠，随着疾病的进展，常伴随有胰腺纤维化区PSCs的激活，特别在纤维化胰岛结构周围［1,3,5］。由于活化的PSCs具有一定的移行能力［15］，因此纤维化区域的PSCs除来源于PSCs的增殖外还可能来自周围活化PSCs的移行。
   
　　目前，糖尿病时PSCs激活的具体机制还不清楚。AGEs是还原糖(主要是葡萄糖)与蛋白质等大分子发生非酶糖基化反应形成的一类结构复杂的化合物。AGEs形成增多是糖尿病的重要特征，与糖尿病并发症之间有密切的联系［16］。AGEs能直接通过修饰ECM，抑制其降解，促进机体纤维化的发生。此外，近有研究发现在尿毒症患者AGEs能通过腹膜间皮细胞的RAGE促进其转分化和腹膜纤维化的发生［9］；在肾小球系膜细胞,AGEs也能通过RAGE诱导其增生肥大和纤连蛋白的合成,从而促进糖尿病肾病的发生和发展［8］，因此，AGEs-RAGE受体途径在纤维化过程中也起着重要的作用。而PSCs和肾小球系膜细胞有许多相似的地方，即激活后都转变为肌成纤维细胞表型［17］，这些研究提示PSCs可能也是AGEs的靶细胞。本实验采用Nycodenz不连续密度梯度离心方法分离培养SD大鼠PSCs,以原代培养3 d和培养14 d的PSCs分别代表静息和体外活化的PSCs，作者首先用免疫细胞化学方法检测到RAGE受体在静息和活化的PSCs均有表达，且活化后的细胞RAGE染色更深，这在半定量高敏感逆转录聚合酶链反应中也得到了进一步的证实，提示AGEs也可能直接通过RAGE受体对PSCs起作用，RAGE的表达上调可能和细胞的活化相关。
   
　　AGEs-RAGE相互作用可通过氧化应激引起血管内皮细胞的凋亡，从而在糖尿病血管病变中起着重要作用［18］。而AGEs的聚集可上调其RAGE受体，该正反馈机制可加速糖尿病微血管和大血管病变的发生［19］。为研究AGEs是否对PSCs有相同的效应，作者用50 mg·L-1的AGEs刺激PSCs 24 h后RAGE受体mRNA水平的表达较同浓度BSA组明显升高，而BSA组和对照组之间没有统计学差异。由此可见，AGEs能促进PSCs RAGE受体的表达，从而对PSCs的影响起到正反馈的作用,这种正反馈机制可能在糖尿病时PSCs的持续激活中起着重要的作用。
   
　　该研究证实静息和活化的PSCs均表达RAGE受体，提示PSCs是AGEs作用的靶细胞，而RAGE受体在PSCs上表达的病理生理意义还需进一步研究。

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　　(本文编辑：杨 博 英文编辑：杨 博）