显微CT与组织切片技术在骨形态计量研究中的比较

      作者：王军，毕龙，白建萍，吕荣，杨彬奎

【摘要】  [目的]通过比较显微CT技术与组织切片技术在骨形态计量分析中的差异，探讨显微CT在骨形态三维结构研究方面的技术优势。[方法]分别应用显微CT和组织切片技术分析不同类型的骨组织标本，并从标本处理、表达形式与测试指标等方面比较两者的差异。[结果]显微CT在反映骨组织三维结构特征和对骨组织“量”与“质”变化的精确测量方面明显优于组织切片技术;而组织切片技术对反映标本局部的细胞形态和生长发育变化等方面则更具优势。[结论]显微CT技术在标本处理、表达形式两方面均提供了全新的测试手段，通过结合组织切片技术能够更加理想地反映骨组织形态和结构的特点。

【关键词】  骨形态计量; 显微CT; 组织切片

　　Abstract: [ob[x]jective]To investigate the technical advantages of micro-CT in the research of three dimensional structure of bone tissues over histological section technology. [Method]Different kinds of bone tissue related specimen were observed by micro-CT and histological section,respectively.The diversity of the sample treatments, result ex[x]pressions and test data were compared.[Result]Micro-CT showed great advantages in displaying three dimensional structure characteristics of bone tissues. Both quantity and quality changes of bone tissues could be precisely determined by micro-CT which was much better than histological section technology. However, histology showed great advantages in displaying the cell figures, growth and differentiation.[Conclusion]Micro-CT provides a novel test method for both sample treatments and result ex[x]pressions. Compound with histological technology, micro-CT can display the appearance and structure of bone tissues more sufficiently.

　　Key words：bone morphometry; micro-CT; histological section

　　骨“量”(Quantity)与“质”(Quality)分别反映了骨的数量或容积以及微结构、骨胶原、骨基质矿化、微骨折发生和修复能力等方面的特征。传统骨形态计量手段主要以二维的骨切片显微图像为分析对象，侧重于骨“量”方面的研究，而骨体积中的三维骨量参数和部分二维结构参数主要是根据体视学原理，推导获得[2]。由于受二维平面及生物标本非均匀性影响，骨“质”的体素结构形态、密度分布、方向分布及功能力学特征等分析则比较困难。显微CT技术以体素为测试单元，在微米级高清晰的扫描重建骨小梁立体结构，除能精确计量标本整体骨量参数外，还能测试大量骨结构参数，为骨组织“量”与“质”两方面均提供了全新的测试方法与手段[2]。本实验通过对不同类型骨组织标本的显微CT扫描分析，比较与传统组织切片计量方式的差异，探讨显微CT在骨形态三维结构方面的技术特长，为骨形态计量研究提供更为精确和完善的技术方法。

　　1 材料与方法

　　显微CT选用美国通用公司GE Healthcare Locus SP显微CT，分析处理软件为Micview三维重建处理软件及ABA专用骨骼分析软件，扫描分辨率根据不同动物骨小梁大小选择6.5～40 μm。扫描标本为骨科动物实验常用的裸鼠、小鼠、大鼠、兔、犬、羊胫骨和股骨标本，部分含金属植入物的骨标本以及不同生物材料体内成骨标本。首先观察显微CT不同分辨率扫描协议对不同动物标本、不同处理方式标本、不同材料标本形态计量的适应性，然后以显微CT骨形态分析指标测试上述标本骨量、骨密度、骨形态几何指标以及骨小梁结构指数、骨小梁各向异性等骨质结构指标，后将所测参数结果与传统二维组织切片进行相关比较。

　　2 结果

　　2.1 显微CT对不同动物、不同处理方式骨标本的适应性

　　不同动物标本扫描重建后显示：裸鼠腰椎骨小梁形态只能用6.5 μm高分辨率扫描，细微结构有少量丢失，但仍能满足基本测试分析;8～10 μm的高分辨扫描协议可满足小鼠骨小梁形态表达，基本无丢失;10～15 μm分辨扫描则有部分骨量丢失，但可完整表达体积大于大鼠的大动物骨小梁形态;21～40 μm扫描模式只适用于兔以上的大动物标本(见表1，图1～3)。　表1 不同动物骨组织适应的扫描分辨率

　　2.2 显微CT对不同种类骨标本扫描、重建的结果观察

　　2.2.1 生物材料体外及体内成骨的观察

　　显微CT可清晰观察支架材料的三维微结构，对比不同组成材料含量、密度、孔径、孔内连通径、孔隙率等多种指标(图4)。并可采用密度与空间配合分割方法，分别测量不同时期材料的降解与新生骨小梁生长状况(图5)。

　　2.2.2 骨科金属固定物与周边骨组织结合状况的观察

　　显微CT对标本扫描后，根据三维重建结果，采取逆推法可对金属钉、骨水泥及周边骨小梁进行三维分割，分别测试骨水泥、骨小梁的密度与含量、结构参数及三维界面的结合度(图6a-c)。 图4β-磷酸三钙支架材料三维重建效果 图5纳米材料植入兔股骨1周后的成骨及材料降解效果 图6植入羊椎体的侧孔灌注骨水泥椎弓根螺钉与周边骨小梁三维重建效果 图6a轴向截面图 图6b钉体与骨水泥分割表面重建图 图6c钉体、骨水泥与骨小粱分割表面重建图2.2.3 微血管生长状况的灌注标本观察

　　显微CT可观察主要动脉三维走向及连续性，应用骨形态计量的部分参数，可测试不同直径动脉的多少与分布(图7a、b)。

　　2.2.4 牙体观察

　　牙釉质、牙本质及牙根管经显微CT扫描重建显示，三者分别具有很强的CT梯度值差，分割良好，形态及密度计量较为便利(图8)。

　　2.2.5 带软骨面观察

　　显微CT可以重建软骨层面，并与面下骨小梁结构重叠构建，观察测量软骨体积、层厚及密度指标，但无法观测片切影像中所表达的软骨细胞静止、增殖、成熟、破裂状况(图9)。

　　2.3 显微CT与病理切片骨形态计量测试比较

　　与二维病理切片骨形态计量参数相比，显微CT骨分析系统提供了6类更丰富的三维结构指标。

　　2.3.1 骨骼矿物质定量

　　将CT数据转换为标准Hounsfield Units后，可以准确定量(见表2)。显微CT骨体积分数(BVF)结果与二维切片结果正相关，骨矿物质密度(BMD)、骨矿物质含量(BMC)结果与双能X线骨密度仪正相关。基于Locus SP特有的组织骨密度(TMD)、组织矿含量(TMC)与骨灰重量极为相近(R2>0.98)，TMD、TMC指标由于直接分割出目标区的骨小梁，而不包括非骨骼部分的体素，因此在测试骨小梁早期细小变化时具有更强的敏感度。 图7a显微CT从去基因小鼠头部重建结果 图7b中分割出脑动脉血管结构 图8牙体釉质、本质及根管三维重建效果 图9大鼠股骨关节面软骨层与层下骨小粱结构重建效果表2 显微CT定量参数参数意 义BVF以体积百分比%表示BMD以mg/cm3的羟基磷灰石表示BMC以mg表示TMD指当前ROI内部被阈值二值化认定为骨骼部分的骨密度TMC二值化后矿物质含量，需注意，TMD、TMC随阈值的改变而改变

2.3.2 体视学(stereology)测量

　　采用与传统2D组织形态学类似的方法分析骨小梁结构。显微CT骨结构参数远优于二维切片骨结构参数，结果是直接三维无偏测试，而二维切片测试则需满足模型假设，同时需要较多平面、较多视野的综合统计。但显微CT却无法完成二维切片骨形成、骨吸收、骨重建等多种动态参数的测量，如类骨质参数、矿化沉积率参数等(见表3)。

　　表3 显微CT体视学指标参 数单位和意义骨骼体积/组织体积(BV/TV)单位(%)骨骼表面积/骨骼体积(BS/BV)骨表面积和骨体积的比值，单位是1/mm骨小梁数量(Tb.N)是指给定长度内骨组织与非骨组织的交点数量，单位是1/mm;可理解为每毫米距离内有多少数量的骨小梁骨小梁间距(Tb.Sp)指骨小梁之间的髓腔平均宽度，单位是mm骨小梁厚度(Tb.Th)是指骨小梁的平均厚度，单位是mmEuler数欧拉数在骨质疏松时降低骨小梁连接密度表示骨小梁网络之间的连接数量，以1/mm3表示

　　2.3.3 直接3D测量

　　提供骨小梁厚度(Tb.Th)和间距(Tb.Sp)的定量测量结果及其伪彩色图示。与二维切片计量相比，3D测量直接以体素无偏测试骨小梁真实厚度与间距，而二维切片一般不在骨小梁轴径正切，因此所测试的骨小梁厚度与间距要小于真实数据(见表4)。

　　2.3.4 各向异性(anisotropy)

　　显微CT衡量骨小梁排列及承受载荷的重要指标，二维切片无法有效反应，它以感兴趣区内部拟和椭圆体的方式直观地显示骨小梁的方向性。松质骨的一个重要的微结构特性是结构的各向异性。各向异性程度(degree of anisotropy)用于测量骨小梁结构的方向性和对称性，指ROI内部椭圆体长径和短径的比值，比值越大表示各向异性的程度越大。该比值通常由椭圆体内部3个互相垂直的椭圆形平面的长径和短径比值表示，即a1/a3、a1/a2和a2/a3。比值为1时，椭圆体为球体，各向异性程度小。在骨质疏松初期，承重骨小梁的DA通常增加，随骨质疏松加剧，DA会减小。

　　表4 显微CT直接测量的参数参 数单位和意义Tb.Th. 3D (pixels)骨小梁厚度，指骨小梁的平均厚度，单位是mmCalib. Tb. Th. 3D (mm)将由体素计算得到的Tb.Th校准为mm表示Tb. Sp. 3D (pixels)骨小梁分离度，是指骨小梁之间的髓腔平均宽度，单位是mm。在多孔材料中，Tb.Sp 即孔隙率(porosity)Calib. Tb. Sp. 3D (mm)将由体素计算得到的Tb.Sp校准为mm表示

　　2.3.5 结构模型指数(SMI)

　　测量骨小梁“板状”或“杆状”的程度，二维切片无法有效反应。松质骨结构衰败的特征是骨小梁从板状成分向柱状成分转变。SMI 结构模型指数通过计算骨骼表面的曲率来描述骨小梁板状(plate-like)和杆状(rod-like)的程度。理想的板状骨小梁和杆状骨小梁的SMI数值分别为0和3。发生骨质疏松时，骨小梁从板状向杆状转变，SMI数值增加。

　　2.3.6 骨皮质分析

　　测量长骨骨干，提供结构力学参数，评估骨骼强度。骨皮质厚度、内径周长、外径周长、骨腔截面面积、骨皮质截面面积等几何指标上，显微CT与二维切片有着相似的算法，只是二维切片测量的是单截面，而显微CT既可进行多个截面的逐一测量，又可进行多层面的综合测量，同时还可测量ROI内皮质骨密度、骨矿含量在X、Y、Z轴向上的惯性距及XY平面的弯曲惯性距。但显微CT不能测量皮质骨生长的单双标表面长度、标记间距离及矿化沉积率等二维切片指标。

　　3 讨论

　　3.1 显微CT与传统骨切片骨形态计量评价与分析

　　与二维切片图象分析相比，显微CT标本的制备大为简化，可将新鲜取材标本直接放入扫描，也可将标本固定、脱水后放入扫描，还可以将包埋好的标本块放入扫描，其骨组织结构与骨密度差异不大[3、4]。这不但省去了切片标本复杂的切取、制备、染色过程，其测试的无损性还可将同一标本扫描后进一步做切片处理，以进行对比分析。

　　显微CT对骨标本的检测是无损性的[5]。因此，前期新鲜标本或固定处理标本，经显微CT检测后，都可进行后期的病理切片染色处理。以新鲜标本为对照，前期不同处理标本的扫描重建后显示：同一标本的新鲜取材与脱水处理、脱脂处理、酒精固定无显著差异，即使敏感的空气部位，CT值也无明显变化;福尔马淋液体对X线有一定的吸收，新鲜取材与浸泡标本在空气部位有一定CT差值，但对骨与骨小梁影响很小，其骨量、骨密度、骨体积无显著差异;树脂包埋后骨标本仍可进行显微CT扫描，树脂部分吸收X线较少，只要放置得当，其骨量、骨密度、骨体积与新鲜标本也无显著差异。但经树脂液浸泡而未固定的骨标本不能上机扫描，部分溶液受X线照射或温度改变会与标本周边的泡沫固定物产生理化反应，使扫描过程中标本位移与倒塌，造成扫描失败。

　　在观察表达形式方面，骨切片为二维平面像素测量、面密度 ，具有习惯中丰富的染色色彩，显微CT则为三维立体体素测量、体密度 ，以三维灰度图像表达，可根据体密度或体积大小进行伪彩色表达。三维立体目标的观察涉及方向与角度，目标体前、后、上、下会有立体遮挡。

　　在测试精度方面，骨切片的二维图像骨形态分析方式，一般采用切面、视野、目标多重抽样、统计，需满足DELESA原则，才能应用体视学原理推断三维参数; 而显微CT直接重建松质骨结构的三维体素图像，具备无偏倚、成像不受二维组织形态计量学中模型假设限制的优点，骨小梁柱状或板状直接测得而无需推测，可进行目标体整体分割测量，在任意方向直接测定骨三维结构、连续性和完整性;所获取的分析数据在标本体内应该是无偏与真实的，且重复性好[6]。显微CT，如骨小梁直接容积与骨小梁表面参数，这两种指标独立于骨小梁厚度，是真实的骨小梁结构，也是建立在一般二维切片基础上的传统组织形态测量所无法解决的。

　　3.2 显微CT的不足

　　显微CT检测很先进、很精确，但成本很高。设备本身200万元，3 000 h寿命球管价值36万元，目前单一标本的一次扫描重建费用在1 000～2 000元左右，因此大样本量的统计实验价格昂贵，目前较多采用的方法是在二维切片基础上选择代表性样本的精确表达与定量，或做完μ-CT扫描重建的标本再进行二维切片的大样本统计;此外在满足扫描分辨率、伪影影响不大的情况下，可选择大号样品杯，一次多标本同时扫描，分别重建，可大大降低扫描成本;显微CT是以X线吸收程度产生影像，对新生软骨、类骨质等目标不是特别敏感，实际应用中应注意控制CT窗口与水平[6];显微CT目前尚不能解决骨形成、沉积和吸收的动态参数测量。

　　显微CT为皮质骨、骨小梁类骨标本“量”与“质”两方面均提供了全新的测试方法与手段，具有不受二维组织形态计量学中模型假设限制，三维成像与三维测量可无偏倚的直接测定骨形态参数，标本处理简单无损等的优点。但也有无法进行骨形成、沉积和吸收动态观测，无法进行类骨质观测，实验成本高的缺陷。因此，显微CT与病理切片在骨形态计量应用中是互补的，而不能完全替代。

【参考文献】
  　　[1] Pettway GJ,McCauley LK .Ossicle and vossicle implant model systems[J].Methods Mol Biol,2008,455:101-110.

　　[2] Virk MS,Conduah A,Park SH,et al.Influence of short-term adenoviral vector and prolonged lentiviral vector mediated bone morphogenetic protein-2 ex[x]pression on the quality of bone repair in a rat femoral defect model[J].Bone,2008,42:921-931.

　　[3] Akhter MP,Lappe JM,Davies KM,et al.Transmenopausal changes in the trabecular bone structure[J].Bone,2007,41:111-116.

　　[4] 彭江, 汪爱媛, 孙明学, 等. Micro-CT在松质骨结构研究中的应用[J].中国矫形外科杂志,2005,13:859-861.

　　[5] Wilensky A,Gabet Y,Yumoto H,et al.Three-dimensional quantification of alveolar bone loss in porphyromonas gingivalis-infected mice using micro-computed tomography[J].J Periodontol,2005,76:1282-1286.

　　[6] Bevill G,Easley SK,Keaveny TM.Side-artifact errors in yield strength and elastic modulus for human trabecular bone and their dependence on bone volume fraction and anatomic site[J].J Biomech,2007,40:3381-3388.