神经导管修复大鼠坐骨神经缺损实验研究

【摘要】 目的：采用一种自行研制的具有良好生物相容性的壳聚糖构建人工神经来修复大鼠坐骨神经缺损,研究证实其修复效果。方法：选用30只健康雄性Wistar大鼠,随机分为正常对照组（A组）、原位神经移植组（B组）、壳聚糖神经导管桥接组（C组)3组，分别切断坐骨神经后做相应处理，12周后进行神经电生理检测。结果：C组12周后神经已经长过缺损段,神经传导功能恢复。结论：这种套管能够有效的桥接10 mm长的大鼠坐骨神经缺损，可应用于周围神经缺损的治疗，同时可以作为进一步开发组织工程化的人工神经的良好载体。

【关键词】 神经导管；周围神经；缺损；壳聚糖

Abstract ob[x]jective: Using a self-developed chitosan with good biocompatibility to build artificial nerves to repair defects in rat's sciatic nerve and a study was made to confirm the repair effect. Methods: 30 healthy male Wistar rats were randomly divided into 3 groups (A: normal control group, B: in situ nerve graft group, C: Artificial neural bridge group). Sciatic nerve were cut off with the deal accordingly, 12 weeks later, the nerve electrophysiological testing was performed. Results:12 weeks later, the nerve has been a long paragraph defect, the function of nerve conduction recovered. Conclusion: This casing can effectively bridge the Sciatic Nerve defect of 10mm in rats and can be used in the treatment of peripheral nerve defects. At the same time it can serve as a good carrier for the further development of tissue-engineered artificial nerves.

　　Key words Nerve conduit; Peripheral nerve; Defect; Chitosan

周围神经损伤在临床中非常多见,在很多情况下,易导致长期且严重的功能障碍。目前临床上常见的治疗方法是自体皮神经移植。但是,由于自体供移植的神经来源有限及供区的失神经损害,其应用受到很大限制。为解决周围神经缺损这一难题,人们曾先后尝试使用包括静脉、去除内膜的静脉、动脉、肌肉、胶原等为代表的生物性材料[1-2]以及硅胶、聚四氟乙烯、多聚乳酸/聚己内酰酮复合物、甲壳素、多聚左旋乳酸、聚乙醇酸等非生物性材料制成的神经导管[3-6]替代自体神经移植物，但均未取得令人满意的效果。我们采用一种自行开发的、具有良好生物相容性的壳聚糖构建人工神经导管来修复大鼠坐骨神经10 mm长的缺损,并通过电生理检查，与大鼠自体神经移植比较研究其修复效果。

　　1 材料与方法

　　1.1 壳聚糖导管的制备

　　取6 g壳聚糖粉，放入烧杯内，用量杯导入蒸馏水到100 mL，滴入冰醋酸2 mL，轻搅拌几下后放置0.5 h后再次搅拌，再放0.5 h，再搅拌，如此数次，直到完全溶解，放置1 d后待用，以便除去内部气泡,此时溶液呈现金黄色，溶胶胶状，均匀粘着。将硬塑料管浸入溶胶，迅速取出垂直放入-80 ℃冰箱中冷冻过夜，然后放入冷冻干燥机中(ALPHA-1-4,Martin Christ公司,德国)干燥。接着，将干燥完全的壳聚糖导管脱模，浸入75 %酒精中脱酸，后将导管用三蒸水洗，干燥后即成为壳聚糖导管，长4 cm，内径1.5 mm，管壁厚0.2 mm，见图1。壳聚糖本身分布均匀，质地韧，有一定黏性。厚度与浓度有一定正向关系。采用以下方法灭菌：先加入75 %(v/v)的乙醇浸泡30 min，然后加入无菌的PBS液洗涤3次。

　　1.2 动物分组与桥接手术选用

　　30只Wistar大鼠(内蒙古大学动物实验中心提供)雌雄不拘，200～250 g,随机分为正常对照组（A组）、原位神经移植组（B组）、壳聚糖神经导管桥接组（C组)3组，采用10 %水合氯醛(3 mL/kg体重)腹腔注射麻醉。A组只暴露双侧坐骨神经；B组在坐骨神经分叉处上方5 mm以及10 mm处切断坐骨神经(两侧断端自然回缩后缺损约10 mm作为神经缺损模型),并分别原位用9-0尼龙线3针外膜缝合。C组在坐骨神经分叉处上方5 mm以及10 mm处切断坐骨神经,移除神经游离段，采用长12.0 mm、内径1.5 mm的人工神经桥接神经缺损,两端分别套入2 mm,9-0尼龙线3～4针固定，见图2。

　　1.3 电生理检测

　　术后12周,同上法麻醉大鼠并固定后,游离双侧坐骨神经,采用成都泰盟科技有限公司BL-420F电生理仪检测。刺激电极先后置于移植物或吻合处的远近端,记录电极置于腓肠肌中段,参考电极置于肌肉。方波、恒压3.0 V刺激、波宽0.1 ms、10 Hz,记录肌肉复合动作电位、运动神经传导速度。

　　1.4 组织学检测

　　术后12周取各组动物坐骨神经的桥接部分，经4 %多聚甲醛固定、石蜡包埋后行纵切面H-E染色，光镜观察再生神经纤维生长情况。

　　1.5 统计学方法

　　采用SPSS10.0统计软件包进行分析,实验数据以x±s表示。组间比较采用计量资料的t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 大体观察

　　术后B、C组动物均行动困难,后肢拖曳行走,针扎足底均无痛觉反应。术后1周,大鼠的后肢功能无恢复,足底水肿。术后2周,B、C组大鼠均出现不同程度的足部溃疡,以C组为重。术后8周,B组大鼠6只足部溃疡已愈合,2只残存溃疡；C组大鼠足部溃疡大部分愈合,1只足部溃疡加重,足趾溃烂。术后12周,B、C各组双侧肢体足部溃疡已经基本恢复。暴露坐骨神经后发现,导管结构完整,周围没有明显炎症反应,亦未见神经瘤形成。

　2.2 电生理检查

　　12周后A、B组双侧坐骨神经以及C组远近端均能诱发肌肉的复合动作电位,将有效数据进行统计分析,首先进行组内以及组间方差齐性检验,各组之间方差平齐(P＜0.05),因此进行单因素方差分析。结果A组与B、C各组之间大神经传导速度和大波幅比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，B、C两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。表1 术后12周各组大神经传导速度和大波幅(略)

　　2.3 组织学检测

　　术后12周再生神经H-E染色显示，B、C组大鼠的再生神经均已从近端长入远端，施万细胞增生明显。B组的再生神经纤维密集，排列整齐；C组再生神经纤维较稀疏，有结缔组织增生。见图3。

　　3 讨论

组织工程学的发展为解决周围神经缺损这一难题提供了机会,但组织工程对支架材料有着较高的要求,如生物可降解性、组织相容性、无不良反应、来源广泛等。综合比较分析上述各种神经导管,甲壳素、壳聚糖可能是较为理想的组织工程材料。壳聚糖为甲壳素脱乙酰基所得,溶解性明显高于天然甲壳素,较易加工成形,也已被研究用于制作多种医学生物材料。我们采用壳聚糖构建人工周围神经。前期研究已经证实壳聚糖具有良好的生物相容性[7-8],而且其物理性质以及吸收周期可以调节控制。壳聚糖导管在大鼠体内逐步降解,在神经修复的早期能够提供支架以及导向作用,并形成局部相对稳定的再生微环境；在神经再生的晚期逐渐吸收降解,并能够根据需要来控制其吸收周期。

周围神经损伤后,功能是否恢复是判断神经再生效果的关键。神经的传导性是周围神经的基本功能,且神经干电活动的传导速度能直接反映神经的传导性。周围神经离断后,神经传导性消失,因此神经传导功能可作为判断神经损伤和修复的一项可靠指标。本研究发现，术后12周神经肌肉复合动作电位的产生，说明再生的神经纤维已经长过缺损段,神经传导功能已经恢复，表明这种导管能够有效地桥接10 mm以内的大鼠坐骨神经缺损,同时经过统计学分析以及电生理结果提示对于10 mm缺损,此种人工神经的修复效果与自体神经移植类似,可以替代自体神经移植。

我们开发的这种神经导管已经证实其修复效果，同时,体外培养结果表明这种导管能使施万细胞粘附于其上生长[9],因此它可以作为进一步开发组织工程化的人工神经的良好载体,我们将进一步通过在导管内添加雪旺细胞和神经营养因子来改善神经修复效果,以期寻找到一种更为有效的神经移植代用品。

【参考文献】
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