液体双试剂测定血氨在全自动生化仪上的运用

【摘要】 目的 在全自动生化仪上建立液体双试剂连续监测法测定血氨。方法 用连续监测法对pH、谷氨酸脱氢酶浓度等反应条件进行实验研究，并进行方法学评价。结果 双试剂连续监测方法，试剂Ⅰ：含三乙醇胺缓冲液（pH7.4）0.25mol/L，α-酮戊二酸15mol/L，NADH 0.3mmol/L；试剂Ⅱ：含谷氨酸脱氢酶≥160u/L。线性范围达321μmol/L，批内Cv=3.4%，批间Cv=8.7%。参考值范围（±2SD）：10.5～44.1μmol/L。结论 本方法操作简便，结果准确，方法合理，符合全自动条件，可推广使用。

【关键词】 血氨；液体双试剂；全自动生化分析仪

　　血氨主要来自肠道内肠菌酶类对未消化吸收的蛋白质氨基酸的腐败作用，以及对尿素分解产生的氨。血氨的测定方法有许多种，如扩散法、去蛋白波氏比色法、离子交换层析法、氨电极法、酶法、干化学法等［1］。但扩散法及波氏比色法灵敏度低，准确性及精密度不佳；离子交换层析法需长时间处理；氨电极法准确度和精密度较好，但稳定性受多种因素影响，尚难普及使用；干试剂酶法可用在半自动生化仪上，但手工操作过程干扰因素多，且干粉试剂溶解后有效期短，难以控制测试的准确度和精密度，加上血氨测定样本少，使测试成本增高。因此，寻找一种更准确、灵敏、简便、经济的测定血氨的方法具有实际意义，笔者拟在全自动生化仪上建立液体双试剂连续监测法测定血氨，结果准确，现报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 仪器 美国贝克曼库尔特公司CX5-CE型全自动生化分析仪。

　　1.2 试剂 ①试剂Ⅰ：装载量100ml，其中含三乙醇胺缓冲液0.25mol/L，α-酮戊二酸15mol/L，NADH 0.3mmol/L，ADP 1.5mmol/L，pH为7.4，2～8℃下稳定半年。②试剂Ⅱ：装载量15ml，含谷氨酸脱氢酶（GLDH） ≥160u/L，2～8℃下稳定1个月。

　　1.3 原理

　　NH+4+α-酮戊二酸+NADHGLDH L-谷氨酸+NAD++H2O

　　NADH消耗速率与NH+4浓度成正比，在340nm处连续监测吸光度的变化率（△A/min）。

　　1.4 方法 ①液体双试剂连续监测法，试剂Ⅰ200μl，样本30μl，试剂Ⅱ50μl，先加入试剂Ⅰ，320s后加入样本，第440s加入试剂Ⅱ。②读空白时间：开始280s，结束300s。③反应时间：开始500s，结束560s。④反应温度：37℃。⑤波长：主波长340nm，副波长410nm。⑥计算公式：

　　NH+4μmol/L=△A/min280×106 6220×30×0.5

　　2 实验结果

　　2.1 适pH 实验溶液的终pH范围为7.0～7.8（用日本拜尔公司850血气分析仪检测），其它条件（温度、时间、酶含量和底物浓度）相同，对一份血浆样本进行血氨检测，结果见表1。表明实验溶液pH越接近7.4，测定值反映越真实。

　　表1 适pH、GLDH浓度观察（略）

　　2.2 GLDH用量选择 试剂Ⅱ中GLDH的活性浓度分别为80，120，160，200，240u/L，其他条件不变，测定一份血浆样本的血氨浓度来观察GLDH浓度，结果显示试剂Ⅱ中GLDH的活性为160u/L时反应曲线已趋平坦，故确定试剂Ⅱ中GLDH的活性浓度为160u/L。见表1。

　　2.3 反应进程 试剂Ⅰ200μl，样本30μl，混合，37℃孵育2min，加入试剂Ⅱ40μl，340nm连续监测5min，仪器每间隔16s读1次吸光度值，根据结果显示在1～3min之间呈线性，因此，设定延迟时间为1min，测定时间1min。

　　2.4 试剂的稳定性 装机试剂每日对一份血氨标准液（浓度为55.5μmol/L，北京中生公司产品）进行测定一次，当测定结果偏离标准值5%时，对试剂Ⅰ、Ⅱ分别更换重测，若结果能得到纠正即为该试剂的有效期，结果本法试剂Ⅰ、Ⅱ有效期分别为：试剂Ⅰ半年，试剂Ⅱ1个月。

　　2.5 线性实验 使用混合病人血浆制备5个水平浓度样本，制备混合血浆准备如下［2］：低浓度χ1混合血浆，高浓度χ5混合血浆；血浆χ2=3份“χ1”+1份“χ5”；血浆χ3：2份“χ1”+2份“χ5”；血浆χ4=1份“χ1”+3份“χ5”。配制的标本浓度按公式

标本浓度=X1×V1+X5×V5 V1+V5

　　计算，在同一工作日内完成测定工作，每个浓度标本重复测定4次，计算平均值，记录结果。通过判断离群点，结果显示，血氨线性可达321μmol/L，=3.465X+0.98，r=0.9997。

　　2.6 精密度试验 取一份血浆样本分别作批内、批间测定20次，批内=38.5μmol/L，S=1.22，Cv=3.4%，批间：=36.7，S=3.21，Cv=8.7%。

　　2.7 参考值 取健康人清晨空腹血样60例，男女各半，采用肝素锂抗凝剂，年龄在14～45岁之间，用本方法测定血氨水平，以±2SD为参考范围。结果男女差异无显著性，参考值为：10.5～44.1μmol/L。

　　3 讨论

　　3.1 从表1中可看出，pH越接近7.4，测定值越能反映样本中真实血氨的浓度，偏离7.4，结果偏低。主要原因是血液中游离氨以NH+4和NH3两种形式存在，是两种形式的总量，是两种形式处于平衡状态。在pH 7.4时，98%以NH+4形式存在，因此，维持试剂溶液的pH为7.4，保证了血氨测试的准确性及稳定性。

　　3.2 抽样时应用肝素抗凝剂，不宜用枸橼酸钠抗凝剂，因为枸橼酸钠抗凝剂分解出H+离子，从而使血氨测定值偏高。我们对20例病人用两种不同抗凝剂（一种是肝素锂，一种是枸橼酸钠）进行抽样，离心10min，转速3000 r/min，同时测定血氨浓度，结果显示，枸橼酸钠抗凝管的血氨浓度平均偏高82个u。

　　3.3 目前使用的血氨干粉酶法试剂盒的参数不符合全自动生化分析仪条件要求［2］，用半自动生化分析仪进行分析干扰因素太多，加样器、试管、溶剂等因素都对血氨结果产生正干扰。且干粉试剂溶解后使用有效期短。为克服此缺点，使血氨试验真正适合全自动分析，我们对试剂配方进行研究发现，血氨测试是否准确，试剂Ⅱ中GLDH酶活力的稳定十分关键，使用双试剂，分开保存NADH和GLDH，用50%甘油配制试剂Ⅱ，同时在试剂Ⅱ中加入一些EDTA-Na，防止金属离子的干扰，测试时试剂临时混合，有效提高试剂的有效期，完全符合全自动生化仪的参数设置。

　　3.4 在测试过程中，交叉污染及环境等因素会影响试剂中酶的活力，加上标本测试较少，因此，上机试剂装载量不宜配制过多［3］，以本科室工作量适当配制，同时做好室内质量控制，发现失控时即可更换试剂，保证结果的可靠性。

【参考文献】
　　［1］ 钱均.临床生物化学和生物化学检验实验指导［M］.2版.北京：人民卫生出版社，2003：56-65.

　　［2］ 石寅皓.全自动生化分析仪限额参数的设置［J］.临床检验杂志，1998，16（2）：95-96.

　　［3］ 叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程［M］.2版.南京：东南大学出版社，1997：235-236.