氧化应激对内皮细胞NFκB、iNOS和NO信号表达的影响

　 何姜,陈闽,刘小莺,王燕萍 作者单位：福建医科大学 附属协和医院，福建省内分泌研究所，福州

　　【摘要】目的:观察氧化剂第三丁基过氧化氢(tBHP)对体外培养的内皮细胞存活率及核转录因子κB(NFκB)、iNOS和一氧化氮(NO)的影响。 方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，用不同浓度的tBHP处理，具体如下：(1)检测细胞存活率。tBHP作用浓度分别为12.5，25，50，100 μmol/L，作用时间分别为30，60，90，120 min，采用MTT法观察;(2)检测NFκB p65、iNOS蛋白表达量及细胞内NO水平。tBHP的作用浓度为50 μmol/L，作用时间分别为30，60，90，120 min，采用Western blot测NFκB p65、iNOS蛋白表达量，Griess化学显色法测细胞内NO水平;(3)iNOS抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯(LNAME，600 μmol/L)预处理内皮细胞24 h，用Griess化学显色法检测细胞内NO水平。 结果tBHP可降低内皮细胞的存活率，且呈时间及剂量依赖性，50 μmol/L tBHP作用30 min细胞核NFκB活化片段p65蛋白表达达高峰，作用60 min细胞质iNOS蛋白达高峰;iNOS抑制剂LNAME可明显抑制内皮细胞NO升高。 结论 氧化应激可引起内皮细胞损伤，其效应可能通过NFκB iNOS NO途径介导。

　　【关键词】 第三丁基过氧化氢; 脐静脉内皮细胞; 氧化损伤;核因子κB; 诱导型一氧化氮合酶; 一氧化氮

　　ABSTRACT: ob[x]jective To explore the effects of Tertbutyl hydroperoxide(tBHP) on NFκB, iNOS and NO in human umbilical vein endothelial cells. Methods Human umbilical vein endothelial cells were cultured in vitro. Cells viability was measured by MTT assay. Nitric oxide levels were measured by Griess assay. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein and NFkBP65 fragment were detected by Western blot. Results Cell viability was reduced in a timeanddosedependent manner after exposure to tBHP at a range of 12.5～100 μmol/L for 30～120 min. The levels of cytoplasmic iNOS protein were elevated and reached a peak at 60 min. The ex[x]pression of nucleus NFkB p65 fragment reached a peak at 30 min after the treatment with tBHP. The levels of Nitric oxide were markedly attenuated after the treatment with LNAME 600 μmol/L for 24 hours. Conclusion NFκBiNOSNO signalling pathway can mediate tBHP induced damage in human umbilical vein endothelial cells.

　　KEY WORDS: Tertbutyl hydroperoxide; human umbilical vein endothelial cell; oxidative damage; nuclear factorκB; inducible nitric oxide synthase; nitric oxide

　　血管内皮细胞参与机体的凝血、免疫、物质转运和生物活性物质释放等重要的生命活动，内皮细胞的损伤在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要作用[1]。现已明确氧化应激增强及氧自由基激活会引起内皮细胞功能的障碍，但其分子机制尚不清楚[2]。已知核转录因子κB(NFκB)参与调控动脉粥样硬化发生的多种基因表达，而肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素1β(IL1β)等细胞因子均为NFκB的有效激活物，由此推测氧化应激可能是通过NFκB介导内皮细胞损伤[3]。本研究采用氧化剂第三丁基过氧化氢(tBHP)诱导内皮细胞氧化损伤，观察内皮细胞存活率、细胞核NFκB、细胞质iNOS蛋白及胞内NO水平的变化，探讨氧化应激对内皮细胞损伤作用及其信号通路。

　　1 材料与方法

　　1.1 药物及试剂

　　tBHP[(CH3)3COOH]、DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)，四甲基偶氮唑蓝(MTT)、左旋硝基精氨酸甲酯(LNAME，美国Sigma公司)，NFκB p65多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，iNOS多隆抗体(美国Millipore公司)，βactin单克隆抗体(武汉博士德公司)，一氧化氮试剂盒(厦门碧云天生物技术研究所)，Western blot化学发光检测试剂盒(厦门天根生化科技有限公司)。

　　1.2 细胞培养与处理

　　选第5～8代人脐静脉内皮细胞(HUVEC，上海拜力生物有限公司)，用含10%的胎牛血清(FBS)的改良Eagle培养基(DMEM)在37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养，约80%细胞汇合时消化。6孔板每孔接种细胞5×105 mL-1，培养16 h后，用不同浓度的tBHP处理，对照组以新鲜无血清培养液培养。于规定时间检测NFκB、iNOS和NO等各项指标。

　　1.3 细胞存活率MTT法测定

　　取上述培养的细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μL，共5×104个细胞，不同浓度(12.5，25，50，100 μmol/L)的tBHP作用30，60，90，120 min，每孔加5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，加DMSO终止孵育，495 nm波长测定各孔吸光度A值，计算细胞存活率，实验重复3次。

　　1.4 NFκB p65及细胞质iNOS蛋白测定

　　经50 μmol/L的tBHP作用30，60，90，120 min后的HUVEC，分别作以下处理：(1)一部分HUVEC先用裂解缓冲液A[mmol/L，HEPES 10(pH 7.9)，KCL 10，EDTA 0.1，EGTA 0.1，DTT 1，PMSF 0.5]400 μL冰上裂解细胞15 min，加入10% NP40(终浓度0.2%)震荡20 s，6 000 r/min 4 ℃离心5 min，将沉淀重悬于50 μL裂解缓冲液B[mmol/L，HEPES 20(pH 7.9)，NaCl 0.42，MgCl2 1.5，EDTA 1，EGTA 1，DTT 1，PMSF 1]，冰上震荡20 min，14 000 r/min 4 ℃离心5 min，上清液留测NFκB p65。(2)另一部分HUVEC用细胞裂解缓冲液[mmol/L，TrisHCL 10(pH 7.4)，NaCl 100，EDTA 1，EGTA 1，NaF 1，Na4P2O7 20，Na3VO4 2，0.1% SDS，0.5%(W/V)sodium deoxycholate，1%TritonX 100，1 mmol/L PMSF，60 μg/mL aprotinin，10μg/mL leupeptin]120 μL冰上裂解细胞20 min，将细胞刮下，混匀后4 ℃ 14 000 r/min离心15 min，吸取上清液，留测iNOS。(3)用BCA法蛋白定量并配平各上清液浓度，取配平后的各上清液35 μg，10% SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳分离蛋白，半干电转移法将分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上，室温封闭1～2 h后加入1∶500的NFκB p65一抗及1∶1 000的iNOS一抗，4 ℃孵育过夜后用1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶耦联的抗兔IgG二抗室温下反应2 h，化学发光法显色，X射线曝光底片。以βactin作为内参照，实验重复3次。

　　1.5 NO测定

　　应用Griess反应检测亚销酸根(Nitrite)，可代表产生的NO的相对量。HUVEC经50 μmol/L tBHP作用不同时间30，60，90，120 min，用细胞裂解缓冲液裂解细胞(参见1.4中iNOS裂解液)，离心后留取上清采用BCA法进行蛋白定量，用NO测定试剂盒检测细胞NO浓度，结果以NO浓度/蛋白含量比值表示。每组5个样品对照，实验重复3次。

　　1.6 LNAME预处理后NO测定

　　LNAME(600 μmol/L)预处理内皮细胞24 h后，50 μmol/L tBHP作用内皮细胞120 min，应用Griess反应检测NO(参见1.5)。

　　1.7 统计学处理

　　数据用x±s表示，选择单因素方差分析进行多组间差异性统计，以P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 tBHP对内皮细胞存活率影响

　　内皮细胞经不同浓度tBHP(12.5～100 μmol/L)作用(30～120 min)后，MTT试验显示，随tBHP剂量增高及作用时间延长，内皮细胞的存活率下降(P<0.01)，表明tBHP可抑制细胞生长，并呈时间及剂量依赖性(图1)，且当tBHP浓度为50 μmol/L时，不同时间细胞存活率区分明显。

　　2.2 tBHP对NFκB p65、iNOS蛋白及NO表达的影响

　　(1)内皮细胞核NFκB p65蛋白含量升高，30 min达高峰，之后下降，而细胞质NFκB p65蛋白含量变化不明显(图2)。(2)内皮细胞质iNOS蛋白含量升高，60 min达到高峰，以后逐渐下降(图3)。(3)tBHP作用60 min后细胞内NO含量呈时间依赖性增高(P<0.001，图4)。

　　2.3 LNAME预处理对tBHP诱导的内皮细胞NO含量变化影响

　　与单纯tBHP作用相比，LNAME预处理的内皮细胞NO含量降低，接近正常水平(P<0.001，图5)。

　　3 讨论

　　糖尿病患者常见的并发症是血管功能异常，心血管事件如冠状动脉性疾病和脑卒中的发生率比正常人多2～4倍，其中氧化应激导致血管内皮细胞损伤是发生动脉粥样硬化(AS)的重要因素[4]。本研究发现，经氧化剂tBHP处理的内皮细胞，存活率下降，细胞核NFκB p65蛋白及细胞质iNOS蛋白表达增加，胞内NO水平增高，iNOS的抑制剂LNAME预处理可以抑制tBHP引起的NO水平增高。

　　NFκB能调节多种炎症和免疫基因表达，是一种重要的转录调节因子，与细胞增生、转化和凋亡等重要的病理生理过程密切相关[5]。它与抑制性蛋白IκB结合呈非活性状态。可被多种刺激剂激活，如细胞因子、氧化剂、脂多糖、紫外线等。激活的NFκB与IκB解离，转入核内与靶基因的κB基序结合，增强其表达。近年研究表明，NFκB是应激与炎症反应的中枢调节物[67]，NFκB能刺激IL1β、cmyc、TNFα基因表达，从而引起细胞凋亡[8]。本研究发现，氧化剂tBHP引起内皮细胞损伤伴细胞核NFκB p65蛋白水平升高，30 min时升高显著。NO具有很强的扩张血管作用，有助于维持组织细胞的血液供应，保证正常功能;但它又是一种典型的自由基，大量的NO可与超氧阴离子发生反应，生成氧化性极强的过氧化亚硝酸阴离子(ONOO),引起脂质过氧化，直接损伤内皮细胞功能，还可通过增加黏附分子及炎性因子的表达引发糖尿病慢性并发症[9];此外，过多的过氧化亚硝酸盐进一步导致硝化酪氨酸水平增高及NO生物活性的降低，进而造成DNA的损伤。在氧化应激条件下，iNOS表达显著增高，从而生成过量的NO造成内皮细胞的损伤。已有资料表明，tBHP通过NO介导引起血管平滑肌细胞损伤[10]。本研究显示，氧化剂tBHP引起内皮细胞NO水平升高，并随作用时间延长而明显增加，iNOS蛋白表达也增加(其中60 min升高明显)，应用iNOS抑制剂LNAME后能显著抑制tBHP引起的细胞NO水平升高，提示iNOSNO介导tBHP对内皮细胞的损伤。而NFκB p65蛋白表达增加更早出现(30 min增加显著)，提示NFκB p65iNOSNO三者在效应上的承接性。

　　综上所述，tBHP可能通过NFκBiNOSNO途径介导内皮细胞损伤。因此干预多种损害因素所引发的NFκB激活可望能减轻对血管内皮细胞的损害，从而延缓或阻止动脉粥样硬化发生，这可能是预防糖尿病血管并发症的一种新策略。本研究只观察tBHP诱导的内皮细胞损伤过程中NFκBiNOSNO通路的变化，尚未观察有关tBHP激活NFκB后下游其它转录产物如TNFα的变化，以及NFκB上游的抑制蛋白(IκB)的变化及其相互关系还需进一步研究。

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