人肿瘤抑素慢病毒表达载体在肝癌细胞中的表达

朱月蓉1,王冰1,李增才2,何玉杰　　作者单位：解放军第八一医院1.生化科;2.肝脏移植中心，江苏　　南京

　　【摘要】目的：观察人肿瘤抑素(tumstatin)对血管生成的抑制作用，探讨肿瘤抑素在肝癌基因治疗中的应用前景。方法：构建人肿瘤抑素慢病毒表达载体pLenti-Tum，经293T细胞包装，收集病毒上清液，感染肝癌细胞株SMCC-7721，收集各组细胞的条件培养基，通过蛋白质印迹分析各组细胞肿瘤抑素的表达情况，并通过人脐静脉血管内皮细胞增殖抑制及迁移试验研究其体外生物学活性。结果： 限制性内切酶酶切分析和测序结果均表明成功构建了肿瘤抑素慢病毒表达载体，以293T细胞包装的重组慢病毒能够高效感染肝癌细胞，肝癌细胞感染重组慢病毒后可高效表达肿瘤抑素并分泌到培养上清液中。体外研究结果表明，重组肿瘤抑素可明显抑制人脐静脉血管内皮细胞增殖及迁移，抑制率分别达35%和41%，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P值均<0.01)。结论： 肿瘤抑素慢病毒表达载体在SMCC-7721细胞中能获得稳定表达，并且重组肿瘤抑素能有效遏制肿瘤的血管生成。

　　【关键词】 肿瘤抑素;肝癌;血管生成

　　[Abstract]　ob[x]jective： To evaluate the antiangiogenic property of vascular endothelial cell in heptocarcinoma cell lines and explore its possible application in the gene therapy of human hepatocellular carcinoma (HCC). Methods： The gene encoding tumstatin was subcloned into lentiviral vector to generate the recombinant vector pLenti-Tum. The vector pLenti-Tum and other packaging vector were contransfected to 293T cells by calcium phosphate. Then SMCC-7721 was infected with recombinant lentivirus and the ex[x]pression efficiency of tumstatin was analyzed by western blot. Proliferation and migration assay of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) was used to evaluate the biological activity of tumstatin in vitro. Results： Restriction enzyme digestion and DNA sequencing demonstrated that the recombinant plasmid Plenti-Tum was constracted . SMCC-7721 secreted tumstatin in the media effectively after infected with the recombinant lentivirus and this protein exhibited strong inhibitory effects on proliferation and mirgration of HUVEC (P<0.01). Conclusion： SMCC-7721 secreted tumstatin effectively after infected with recombinant lentivirus and this recombinant tumstatin may exert inhibitory on tumor antiangiogenic.

　　[Key words]　tumstatin; hepatocellular carcinoma; angiogensis

　　肿瘤抑素(tumstatin)是一种来源于内源性细胞外基质的新生血管抑制剂，具有强大的抑制血管生成效应，能特异性作用于肿瘤血管内皮细胞，抑制其蛋白质的合成，而且不影响正常的血管内皮细胞功能[1-2]。肿瘤抑素及其肽独特的作用机制和效应使其成为极具潜力的新型抗肿瘤生物制剂。我们构建了肿瘤抑素慢病毒载体，感染肝癌细胞株SMCC-7721，并通过人脐静脉血管内皮细胞增殖和迁移试验研究其体外生物学活性，旨在为进一步研究肿瘤抑素的功能和为肝癌的基因治疗奠定基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料与主要试剂

　　肝癌细胞株SMCC-7721、人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells， HUVEC)ECV-304购自上海细胞生物研究所，293T细胞、慢病毒表达载体pLenti-GFP由南京医科大学附属医院高云博士惠赠。DMEM和1640细胞培养基、胎牛血清、Trizol试剂为Invitrogen公司产品;限制性内切酶、T4连接酶、质粒提取试剂盒、RT试剂盒及非放射性细胞增殖检测(MTS)试剂盒为Promega公司产品;polybrene购自Sigma公司;兔抗人COL4A3多克隆抗体购自ProteinTech公司。

　　1.2　方　法

　　1.2.1　人肿瘤抑素基因的克隆

　　利用Trizol试剂，从人肾癌旁组织中提取总RNA，逆转录为cDNA，然后以F1、R1为引物进行PCR扩增。上游引物F1：5′-CCAGGTTTGAAAGGAAAGCGT-3′(由于引物设计需要，将肿瘤抑素第18位碱基同义突变为G);下游引物R1：5′-AGCTTCAGTGTCTTTTCTTCATGC-3′。PCR反应条件为94 ℃ 45 s,56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min,30个循环;72 ℃ 延伸10 min。将PCR产物克隆入pGEM-TEasy载体中，由南京金思特公司测序鉴定，序列正确的克隆命名为pGEM-Tum。

　　1.2.2　添加信号序列

　　用来添加信号序列的引物为F2、R2，F2含有小鼠的IgK信号序列，R2为下游引物，为了提高PCR效率和特异性，F3序列与F2前22个碱基相同。引物序列如下，F2： TTACGCGT ATGGAGTCAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCT GCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTCCAGGTTTGAA AGGAAAG (下划线处为MluⅠ酶切位点)， R2： GCGTCGACAGTGATTAGCTTCAG(下划线处为SalⅠ酶切位点)，F3： TTACGCGTATGGAGTCAGACAC(下划线处为MluⅠ酶切位点)。以上述pGEM-Tum质粒为模板，F2、R2、F3为引物进行PCR扩增，PCR过程分为两部分。部分20个循环，循环参数为94 ℃ 45 s,66 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min，其中退火温度每一循环降低0.5 ℃，第20个循环时退火温度为56 ℃;第二部分15个循环，退火温度保持为56 ℃，其余循环参数与部分相同。

　　1.2.3　肿瘤抑素重组慢病毒表达载体的构建

　　利用MluⅠ和SalⅠ对添加完信号序列的肿瘤抑素 PCR产物进行双酶切，酶切产物纯化后，将其克隆入经同样双酶切的慢病毒载体pLenti-GFP，构建重组慢病毒表达载体pLenti-Tum。

　　1.2.4　病毒包装

　　用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，进行1 ∶4传代，37 ℃，5%CO2培养箱内培养，细胞密度达70%时转染。制备慢病毒包装系统中3种质粒混合DNA溶液(pLenti-Tum或pLenti-GFP 20 μg，pLR/VSV-G 6 μg，pCMVΔ8.91 15 μg)，无菌水定容至500 μl，加入2×HBS磷酸盐缓冲溶液500 μl，再加入CaCl2(2.5 mol/L)溶液50 μl，轻轻混匀，室温放置20～25 min。给293T细胞换液，加入5 ml新鲜的含10%FCS的DMEM溶液;然后将DNA磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中。培养8 h后，弃去含有转染混和物的培养液，加入10 ml新鲜培养液。24 h后，荧光显微镜下观察质粒转染效率;转染48 h后，收集293T细胞上清液。4 ℃，1 500 r/min离心5 min后，以0.45 μm滤器过滤后于-70 ℃冰箱中保存。

　　1.2.5　病毒滴度测定

　　将293T细胞按照2×105/孔接种于6孔板上，吸附6 h后，将所收集的pLenti-GFP和pLenti-Tum病毒上清分别按对数级稀释，将1 ml稀释后的病毒上清分别加入到相应的孔中，同时加入6 μl polybrene(1 μg/μl);3 h后，在每孔加入1 ml新鲜培养液;过夜培养后，更换培养液，48 h后，收集293T细胞于流式细胞仪检测GFP阳性细胞百分数，用下面的公式计算病毒滴度。病毒滴度(transduction units，TU/ml)=病毒感染时细胞数×GFP阳性细胞百分数×相应的稀释倍数。

　　1.2.6　慢病毒感染肝癌细胞

　　pLenti-Tum重组慢病毒体外感染肝癌细胞SMCC-7721，同时以pLenti-GFP病毒感染SMCC-7721作为对照。在病毒感染前，吸去SMCC-7721(10 cm培养皿)中的培养液，加入5 ml病毒上清，再加入30 μl(1 μg/μl)polybrene，37 ℃、5%CO2培养3 h，补液至10 ml。继续培养，24 h后换液。48 h后，在荧光显微镜下观察对照组GFP表达;72 h后，胰酶消化、收集细胞，FACS检测GFP的表达，以初步判断肿瘤抑素基因的转化效率。将pLenti-GFP、pLenti-Tum病毒转染细胞分别命名为SMCC-7721-GFP和SMCC-7721-Tum。

　　1.2.7　条件培养基的制备

　　将1×106 肝癌细胞SMCC-7721接种于10 cm的培养皿中，24 h后分别以pLenti-GFP和pLenti-Tum病毒液感染SMCC-7721。感染24 h后，以10 ml不含小牛血清的DMEM换液，继续培养48 h后，收集各组细胞的培养上清;用Millipore超滤离心管浓缩10倍，并通过0.45 μm滤器过滤后备用。

　　1.2.8　重组表达产物的蛋白质印迹分析

　　各组细胞的条件培养基经12%SDS-PAGE电泳分离后，转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h;一抗为兔抗人COL4A3多克隆抗体(1 ∶500稀释),4 ℃孵育过夜;二抗为辣根过氧化物酶(HRP)耦联的羊抗兔IgG(1 ∶2 000稀释)，室温孵育2 h，化学发光显色。

　　1.2.9　HUVEC增殖抑制实验

　　对数生长期ECV-304以5×103/孔接种于96孔培养板，培养24 h后吸去培养上清，然后分别加入100 μl未转染SMCC-7721、SMCC-7721-GFP及SMCC-7721-Tum条件培养基，实验每组设3个复孔。继续培养48 h后，用MTS系统检测HUVEC的细胞增殖情况。酶标仪测量490 nm处光密度(D)值，以实验组与未转染组的光密度比值来评价肿瘤抑素对HUVEC的增殖抑制。

　　1.2.10　HUVEC迁移抑制实验

　　通过8.0 μm 24孔Transwell检测培养上清中的肿瘤抑素对HUVEC的迁移抑制作用。分别吸取600 μl各组细胞条件培养基于Transwell下室，实验每组设3个复孔。收集对数生长期ECV-304，以不含血清的RPMI-1640重悬细胞，将细胞浓度调整为5×105/ml，吸取100 μl ECV-304细胞悬液置于Transwell上室。培养24 h后，用棉拭子擦去上层的非迁移细胞，而迁移到下层的细胞先用甲醇固定，然后用结晶紫染色，在光学显微镜下计数每个高倍视野下的迁移细胞数。

　　1.3　统计学处理

　　应用SPSS13.0 统计软件进行统计学分析，实验所得数据用x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　人肿瘤抑素基因的克隆和鉴定

　　人肿瘤抑素由244个氨基酸组成，核苷酸序列为738 bp，PCR产物预期大小为742 bp。本实验利用肿瘤抑素特异性引物扩增的PCR产物在750 bp处显示为单一条带，与预期大小一致。经测序证实，除18位A同义突变为G，该片段与基因库中报道的肿瘤抑素基因序列完全一致(图1)。M：标准参照物;1：人肿瘤抑素基因PCR扩增产物图1　PCR 扩增肿瘤抑素电泳图

　　2.2　信号序列的添加及慢病毒表达载体的构建

　　用PCR方法添加信号序列，加有信号序列的目的片段为826 bp。加有信号序列的肿瘤抑素PCR扩增片段经MluⅠ和SalⅠ双酶切后，亚克隆至经同样双酶切的pLenti-GFP载体，得到重组质粒pLenti-Tum。利用Mlu I和SalⅠ对重组质粒进行双酶切鉴定，在800 bp处可见目的条带(图2)。经测序证实，该插入片段与预期结果一致(图3)。M：标准参照物;1： MluⅠ和 SalⅠ双酶切重组质粒pLenti-Tum图2　肿瘤抑素重组慢病毒表达载体的酶切鉴定图3　人肿瘤抑素cDNA 序列分析鉴定

　　2.3　293T细胞的包装效率及慢病毒的转染效率

　　将慢病毒包装系统中3种质粒用磷酸钙共沉淀法转染293T细胞，24 h后在荧光显微镜下观察GFP表达情况。该方法转染效率很高，说明重组病毒被成功包装(图4)。病毒滴度测定显示，pLenti-GFP病毒滴度为7.52×107 U/ml，pLenti-Tum病毒滴度为5.38×107 U/ml。病毒原液感染肝癌细胞48 h后，在荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况，几乎所有的细胞均发出绿色荧光(图5)，流式细胞仪检测感染效率为95%以上。图4　肿瘤抑素重组质粒转染293T细胞(10×)图5　肿瘤抑素重组慢病毒感染肝癌细胞SMCC-7721(20×)

　　2.4　基因转染肝癌细胞的肿瘤抑素体外表达

　　肿瘤抑素相对分子质量为28 000，为了观察慢病毒转染的肝癌细胞能否分泌表达该蛋白，我们收集了未转染SMCC-7721、SMCC-7721-GFP及SMCC-7721-Tum的条件培养基并进行免疫印迹分析。图6显示，SMCC-7721-Tum在28 000处有较高水平的表达，而未转染SMCC-7721 和SMCC-7721-GFP未检出肿瘤抑素的表达。1： SMCC-7721; 2： SMCC-7721-GFP; 3： SMCC-7721-Tum图6　各组肿瘤细胞条件培养基的免疫印迹分析

　　2.5　肿瘤抑素的体外生物学活性检测

　　SMCC-7721感染重组慢病毒后，可在其培养上清中分泌肿瘤抑素。为了研究该分泌蛋白是否具有生物学活性，我们通过HUVEC增殖及迁移实验对转染细胞培养上清进行了检测。结果显示，实验组SMCC-7721-Tum的条件培养基对HUVEC的增殖和迁移有明显抑制作用，其抑制率分别可达35%(F=100.056，P<0.001)和41%(F=83.315，P<0.001) ，而空载体组条件培养基则不影响HUVEC的增殖和迁移(图7、图8)。

　　3　讨　论

　　基膜是广泛存在的特殊的细胞外基质薄层组织，Ⅳ型胶原是存在所有血管基膜的主要大分子物质，它在内皮细胞增殖和新血管形成中起着重要作用。Ⅳ型胶原由三个结构域组成：N末端的7s结构域、中间三螺旋体结构域和C末端的球形非胶原结构域1(NC1)，其中NC1结构域在Ⅳ型胶原的组装和形成三螺旋体以及基底膜的构成中都起着关键性作用[3-4]。肿瘤抑素主要是Ⅳ型胶原的三螺旋体的C末端NC1结构域，相对分子质量为28 000，它由244个氨基酸组成，其中232个氨基酸位于NC1结构域，还有12个氨基酸来自于N末端[5]。

　　大量的研究结果表明，实体肿瘤的生长和转移均依赖于肿瘤新生血管的形成。抑制肿瘤血管生成是肿瘤分子靶向治疗的有效途径，也是基因治疗的有效靶点。肿瘤血管内皮细胞的增殖依赖于血管内皮细胞和相关蛋白质的有效合成，肿瘤抑素是一种内源性肿瘤血管生成抑制基因，它能特异性作用于血管内皮细胞，在蛋白质水平整体上抑制细胞的蛋白质合成、诱导内皮细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤血管生成的生物学作用， 因此肿瘤抑素与其他肿瘤血管抑素相比，具有抗肿瘤血管生成作用强、特异性高的特点[6]。在基因转移方法中，用慢病毒载体作为基因转移的工具既可以转染非分裂期细胞，又可以使目的基因整合至靶细胞基因组长期表达。本研究所用的慢病毒载体为一种自身失活型载体，一旦转移到靶细胞，就丧失了病毒长末端重复的转录能力，减少了产生重组病毒的机会，具有很高的安全性[7]。本研究利用293T细胞包装的重组病毒可以有效感染肝癌SMCC-7721细胞，且转染细胞产生的肿瘤抑素在体外能够明显抑制HUVEC的增殖与迁移，为进一步研究肿瘤抑素基因的功能和为肝癌的基因治疗奠定了基础。