不同处理和保存条件下体外HCV RNA稳定性研究

　作者：刘长利　任芙蓉　吕秋霜　刘景汉　庄辉　　作者单位：中国人民解放军总医院输血科，北京 100853; 1北京市红十字血液中心，北京 100088; 2北京大学医学部病原生物学系，北京 100083

　　【摘要】对献血者或病人进行HCV核酸检测时，如果标本的采集、处理、保存不当，会造成病毒核酸降解，从而影响检测结果的真实性。本研究的目的是对不同抗凝剂、不同温度、不同保存时间下的HCV RNA病毒稳定性进行研究，以考察常规采供血过程中，标本采集及保存方式对NAT检测的影响。 采集7例HCV RNA阳性献血者的血样，采用不同的抗凝剂、经不同的温度和不同的时间保存后，采用荧光定量PCR方法测定HCV RNA病毒含量，考察HCV RNA的稳定性。 结果表明： ①不同抗凝剂抗凝的全血于4℃保存48小时过程中, 病毒含量下降至原滴度的42.7%;EDTA抗凝组各时间点的滴度均低于其它3组(分别相当于其它3组的67.6%-25.1%)。②ACD抗凝的全血在4、25和37℃保存48小时，病毒含量分别下降到原滴度的53.8%、72.5%、29.8%。③ACD抗凝的全血离心分离出血浆，4℃或25℃继续保存7天,病毒含量分别下降至原滴度的70.9%和25.1%。④ACD抗凝的全血分离的血浆，反复冻融4次，病毒含量下降到原滴度的38.9%。 结论： ①用于核酸检测的标本应该用无菌采血管采样;②在无菌采血管采样的前提下，核酸检测标本用未抗凝血、EDTA、ACD、CPDA抗凝血均可;③采集的全血应避免放置37℃以上，ACD抗凝全血在4℃、25℃保存48小时内、37℃保存14小时内,HCV RNA病毒仍较为稳定; ④分离后的血浆应避免放置25℃以上，ACD抗凝全血分离后的血浆在4 ℃保存7天，25 ℃保存3天，HCV RNA病毒仍比较稳定;⑤血浆标本应避免多次冻融，但冻融3次的血浆HCV RNA病毒含量仍然较为稳定;⑥无菌采样对维持病毒的稳定性非常重要;单纯的机械性溶血并不会明显导致病毒的降解;只要注意无菌的问题和有合适的核酸提取方法去除血红素，HCV RNA病毒实际上比以前认为的要稳定得多。

　　【关键词】 丙型肝炎病毒; 丙型肝炎病毒RNA; 病毒稳定性; 保存条件; 抗凝剂

　　Stability of Hepatitis C Virus RNA in Various Processing and Storage Conditions　LIU Chang-Li，REN Fu-Rong1， L Qiu-Shuang1， LIU Jing-Han， ZHUANG Hui　　Department of Blood Transfusion, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China; 1Beijing Red Cross Blood Center，Beijing 100088，China; 2Department of Pathogenic Biology, Peking University Health Science Center, Beijing 100083, China

　　AbstractThe study was purposed to investigate whether processing and storage conditions might influence the stability of the HCV RNA in whole blood or in plasma. The samples obtained from seven patients known to be positive for HCV RNA were kept in different storage conditions with different anticoagulants, and at the end of processing the plasma samples were frozen at -80℃ until fluorescent quantitative PCR testing. The results showed that there was no significant loss of HCV RNA titers in whole blood anticoagulated with CPDA or ACD or EDTA or none(P>0.05), while diffe-rences in comparison of the EDTA-anticoagulant storage condition with three other anticoagulants storage conditions at 4℃ after 48 hours were significant (P<0.05). The HCV RNA level decreased to 53.8%,72.5% and 29.8% after 48 hours of storage of whole blood anticoagulated with ACD at 4℃, 25℃ and 37℃ respectively. The HCV RNA level of plasma samples stored at 4℃ and at 25℃ (room temperature) after 7 days decreased to 70.9% and 25.1% respectively. After four freeze-thaw cycles the HCV RNA level decreased 38.9% in plasma samples. It is concluded that the HCV RNA is stable relatively. The HCV RNA is resistant to degradation under routine laboratory handling and storage conditions or blood collection, transport and processing conditions. The influence of different anticoagulants on the stability of HCV RNA is different. Blood samples would better be stored at 4℃ after collection and plasma separated within 48 hours. And it is important for the stability of HCV RNA undergoing asepsis blood collection process. HCV RNA remains stable at 4℃ for at least 7 days or at room temperature for 3 days, allowing greater flexibility in samples collection and transport in transfusion practice nowadays. HCV RNA in plasma samples subject to up to three short-term freeze-thaw cycles is still stable.

　　Key words HCV; HCV RNA; virus stability; storage condition; anticoagulant

　　血浆中HCV RNA病毒含量测定通常被用于评估丙型肝炎病人的疗效及分析预后等。对于检测结果的准确性来说，标本的采集、处理、保存是否得当是非常重要的。一般认为，RNA病毒离体后容易受到外界环境的影响而降解，因此对样品的处理方式、保存温度、时间、是否溶血等都有较高的要求。核酸检测技术已在许多国家的献血员血液筛查中应用，我国一些血液中心也在陆续进行一些核酸检测可行性和必要性的评估工作。但目前，对于HCV RNA样本的采集、处理、保存稳定性研究缺乏全面的报道，尤其是针对在采、供血机构中用于核酸检测血液筛查标本的采集、处理、保存的标准未见报道。在本研究中，我们对不同抗凝剂、不同时间和温度条件下处理和保存的HCV RNA病毒进行定量测定，以探讨影响体外RNA病毒稳定性的因素。

　　材料和方法

　　样本来源

　　血液样本来自2003年到2004年北京血液中心无偿献血的献血者中7例HCV RNA阳性且未经过治疗的无偿献血者。

　　样本采集

　　按照常规献血员血液采集的标准操作规程和方法采集HCV RNA阳性者血液约100 ml，分别用ACD、CPDA、EDTA抗凝或不抗凝(未抗凝血)。采集后的血液立即移至百级净化台内进行无菌分装，将3种抗凝血分装于2 ml无菌Ep管中，每管1.0 ml，用于用不同抗凝剂采集血液、不同时间分离血浆(血清)及不同温度保存全血的研究。将分装完时作为0小时对照。同时将一部分ACD抗凝血置于50 ml无菌离心管中(美国Corning公司产品),25℃放置6小时后1 000×g离心10分钟分离血浆，然后分装于1.5 ml无菌Ep管，每管0.5 ml，用于不同温度保存的血浆及反复冻融血浆处理的研究。以上样品处理操作均为无菌操作。

　　样本处理

　　不同抗凝剂采集和保存的全血将未抗凝的血和CPDA、EDTA、ACD抗凝血置4℃冰箱中静止保存，于1、3、6、12、24、48小时各取2管(Ep管)，颠倒混匀3次后，4℃ 1 000×g离心10分钟分出血浆或血清。此外CPDA、EDTA、ACD抗凝血于分装后即刻离心分出血浆，作为0小时对照。 -80℃冻存，等待统一检测。

　　不同温度保存的全血选用ACD抗凝全血，分别保存于4℃冰箱、25℃水浴、37℃水浴，然后于1、3、6、12、24、48小时各取2管，颠倒混匀3次后，4℃ 1 000×g离心分出血浆或血清， -80℃冻存，等待统一检测。

　　不同温度保存的血浆选用ACD抗凝血25℃保存6小时离心后分装的血浆，于4℃、25℃继续保存1、3、5、7天， -80℃冻存，等待统一检测。

　　冻融处理选用ACD抗凝于25℃保存6小时离心后分装的血浆，做1-4次冻融处理，冻融条件： -80℃冻存至少1天;室温1小时，颠倒混匀后，放入-80℃。 -80℃冻存，等待统一检测。

　　RNA病毒含量检测

　　使用Roche核酸提取柱提取核酸，用深圳匹基公司HCV荧光定量PCR检测试剂盒和美国 Research公司的Opticon 荧光定量PCR检测仪进行扩增和检测。为避免核酸定量存在批间差异，每例HCV RNA阳性献血者的所有处理样品均在同一次Run中进行。

　　核酸提取使用Roche核酸提取柱，按试剂盒说明提取核酸。 每个2.0 ml离心管中加入200 μl待检测样本，各加入200 μl结合缓冲液( binding buffer)工作液及50 μl蛋白酶K溶液，迅速混合均匀，于72℃温浴15分钟(HB-1000型恒温金属浴，杭州大和公司FerroTec产品)。各管中加入125 μl异丙醇，混合均匀，转入加套管的提取柱，8 000×g离心1分钟。将装有滤出液的套管丢弃，换上新套管，向提取柱中加入500 μl除抑制物缓冲液(inhibitor removal buffer)工作液于8 000×g离心1分钟;换上新集液管，向提取柱中加入450 μl洗涤缓冲液(wash buffer)工作液于8 000×g离心1分钟;换套管，再次用450 μl洗涤缓冲液工作液洗涤后，首先以8 000×g离心1分钟，然后13 000×g离心10秒以去除痕量的洗涤缓冲液。每个提取柱换上1.5 ml离心管，室温放置3分钟，向提取柱中加入50 μl洗脱缓冲液( elution buffer)，于8 000×g离心1分钟收集滤出液，于4℃保存备用。

　　核酸扩增和检测采用深圳匹基公司HCV荧光定量PCR检测试剂盒，美国Opticon 荧光PCR仪进行检测。按试剂盒要求配制反应液。每个反应体系含： HCV RT-PCR反应液29.6 μl, Enhancer 0.4 μl, RT-PCR逆转录酶0.25 μl。 取待测样品滤出液或阳性参控品各20 μl, 反应总体积50 μl, 扩增和检测参数为： 42℃ 30分钟;95℃ 3分钟;95℃ 10秒;55℃ 30秒;72℃ 60秒，共5个循环;然后95℃ 5秒,60℃ 30秒,共42个循环，然后读取荧光。

　　结果判定扩增的结果由仪器软件自动分析给出结果。

　　实验数据可靠性为避免核酸定量存在批间差异，同1例HCV RNA阳性献血者的所有处理样品均在同一次Run中进行。为确保定量工作的准确性，采用了Roche核酸提取柱以确保核酸提取过程中的回收率和重复性。实验所用的匹基公司的荧光PCR核酸检测试剂是国内早获得批准文号的HCV PCR临床诊断试剂。本实验室于2003年5月被卫生部临床检验中心批准为核酸检测实验室，并曾使用该方法进行了大标本量的核酸检测工作[1]。

　　统计学分析

　　冻融对HCV RNA的影响采用SPSS 10.0软件进行双因素方差分析，其它组内统计资料采用SPSS 10.0软件进行重复测量方差分析;组间统计资料采用SAS 6.12软件进行重复测量资料趋势性方差分析。

　　结果

　　HCV RNA阳性献血者病毒含量

　　本研究中的7例HCV RNA阳性献血者病毒含量见表1。7例阳性标本经采血后立即检测，其HCV RNA病毒含量都在106copies/ml左右，均属于HCV病毒强阳性标本。Table 1. Amount of HCV RNA of seven untreated donors(略)

　　不同抗凝剂对全血中HCV RNA稳定性的影响

　　用不同抗凝剂抗凝的全血于4℃保存48小时,其HCV RNA的变化见表2。结果表明，各抗凝组在4℃保存48小时过程中，病毒含量均略有下降，下降幅度不大，≤0.37 Log,亦即各处理组4℃保存48小时的病毒滴度下降至原滴度的42.7%。但EDTA抗凝组各时间点平均低于其它3组0.17-0.60 Log(重复测量资料趋势性方差分析P<0.05)，即其它3组的67.6%-25.1%。

　　不同保存温度对全血中HCV RNA稳定性的影响

　　表3为ACD抗凝全血在4℃、25℃和37℃保存0-48小时 HCV RNA含量变化。ACD抗凝全血在4℃、25℃和37℃保存48小时，病毒含量均略有下降，分别下降了0.27、0.14和0.56 Log,相当于下降原病毒滴度的53.8%、72.5%、29.8%。Table 2. Impact of different anticoagulants on the stability of HCV RNA in 4℃ strored whole blood (略)Table 3. Impact of different strage temperatures on the stability of HCV RNA in whole blood (略)

　　不同温度下保存的血浆样品中HCV RNA的稳定性

　　ACD抗凝的全血离心分离出血浆后，在4℃和25℃继续保存过程中HCV RNA含量的变化见表4。由表4可见，保存过程中病毒含量均略有下降，4℃和25℃继续保存7天,分别下降了0.15 Log和0.60 Log,相当于下降至原病毒滴度的70.9%和25.1%。Table 4. Impact of storage at different temperatures on the stability of HCV RNA in plasma samples (略)

　　反复冻融对HCV RNA的稳定性的影响

　　ACD抗凝的全血分离的血浆，经过-80℃/室温反复冻融1、2、3、4次，病毒含量略呈下降趋势，与未冻融组(对照)比较，冻融4次组病毒含量下降了0.41 Log,也即下降到原滴度的38.9%(P<0.05)(表5)。Table 5. Impact of repeat freeze-thaw on the stability of HCV RNA in plasma samples (略)

　　讨论

　　本项实验研究重点考察不同种类的抗凝剂、温度及冻融次数对HCV RNA病毒的影响。结合国内采供血机构特点，采用了几种常用的抗凝剂，并在处理时间设计上考虑到街头血液采集的特殊性，做出了相应的调整。临床标本常用肝素和EDTA抗凝，由于肝素是一种非特异的核糖核酸酶抑制剂，不能通过酚提法将其去除，对PCR检测有严重干扰[2,3]，因此临床用于核酸检测的标本常用EDTA抗凝。在采供血系统，常用ACD、CPDA作为全血的保养液，它们既有抗凝剂的作用，又有保护红细胞的作用，使得血液中的红细胞在其有效保存期内维持完整的结构、活性和功能。如果在献血者中实施核酸检测，是否可以用ACD、CPDA抗凝的血呢?各种抗凝剂的效果如何?因此，本研究重点对EDTA、ACD、CPDA三种抗凝剂及非抗凝血(作为对照组)进行了研究。本研究结果显示，各处理组在4℃保存48小时过程中，病毒含量均略有下降，但下降幅度不大，非抗凝组、ACD抗凝组及CPDA抗凝组全血4℃保存48小时时，病毒含量下降<0.30 Log,也即病毒滴度下降至原来的50%以上。这一结果说明在4℃的环境下，不论抗凝或不抗凝，全血样本中RNA病毒均较为稳定。本研究中，我们发现一个与预期结果不一致的现象，EDTA组在采血后即刻及各时间段的含量均低于其它3组0.17-0.60 Log(重复测量资料趋势性方差分析P<0.05)，即分别相当于其它3组的67.6%-25.1%。我们曾担心，ACD抗凝剂可使血液样品稀释20%(200 ml全血中需加入ACD抗凝剂50 ml)，CPDA抗凝剂也使血液样品稀释了12.5%(200 ml全血中需加入ACD抗凝剂28 ml)，会影响到病毒含量的测定值(可能会低于EDTA组)。但研究的结果却是， EDTA抗凝组从采血后即刻起就低于其它3组。在分析原因时，我们注意到虽然后续样品处理均为无菌操作，但从生产厂家了解到，本研究所用的EDTA抗凝真空管(北京创格医疗公司生产)仅仅是抽了真空，但并未做无菌处理。由此，EDTA抗凝组偏低的原因可能是由于非无菌造成的，是由于抗凝剂内和采血管壁上存在的外源性RNase引起的。王露楠等[4]发现，采用未灭菌的普通一次性塑料试管和灭菌离心管收集血样，即使凝集后立即离心，前者比后者平均下降37.3%;黄呈辉[5]等曾发现用未高压灭菌的玻璃试管留取标本于4℃保存至第2天分离出血清或血浆，在12份抗 HCV阳性的标本中,仅检出2份HCV RNA阳性,HCV RNA在储存中被降解或丢失。因此，我们认为核酸检测标本应注意无菌留样。本研究中，趋势性分析比较表明，未抗凝组与ACD抗凝组及CPDA抗凝组间差异无显著性(P>0.05)，这一结果与一般认为的RNA病毒在未抗凝血中的稳定性较差[4,6]不符。我们认为，可能与所采用的测定方法不同有关。有研究表明，血红素可通过其卟啉环与Taq酶的不可逆结合而抑制Taq酶活性，从而会严重影响PCR测定[7，8]。本研究中，未抗凝组标本在标本离心前剥离、分装血清处理过程中，部分标本溶血现象非常明显，但核酸定量测定结果显示未抗凝组核酸量并未偏低。本研究中采用Roche核酸提取柱提取核酸，在提取过程中去除了血红素分子，避免了血红素分子对Tag酶的抑制作用，因此溶血标本中核酸含量测定值没有偏低。此外，就溶血会不会影响HCV RNA测定的问题，本研究曾将HCV RNA阳性donor 1标本分别用无菌采集的未溶血的阴性血浆及无菌采集的严重溶血的阴性血浆稀释至浓度为1×104 copies/ml的HCV RNA低拷贝标本，4℃过夜使红细胞中释放的RNA酶有机会充分降解 HCV RNA, 第二天用美国Chiron 公司的Procleix HIV/HCV Assay 血液筛查试剂(国际定性血筛试剂)进行检测，结果严重溶血的标本并未影响标本中HCV RNA的检出。Procleix HIV/HCV Assay检测系统中核酸提取采用磁珠吸附的方法，可去除血红素。这些结果都说明单纯的机械性溶血并不会引起 RNA的明显降解;如果能在扩增模板制备时将血红蛋白去除，则单纯的机械性溶血不会影响扩增。2003-2004年，北京血液中心常规采集献血者血液90%以上用ACD抗凝，因此本研究关于保存温度、冻融对稳定性的研究均采用了ACD作为抗凝剂。由于采血现场条件的限制，采集的标本不可能即刻分离出血浆;此外，标本的储存条件可能受限制，有时有4℃冰箱，有时可能只能室温环境放置。为了调查采集的全血标本分离血浆时间不同以及储存温度不同对RNA稳定性的影响，我们对ACD抗凝全血在4℃、25℃和37℃保存0-48小时 HCV RNA含量变化进行了研究。研究结果表明，ACD抗凝全血在4℃、25℃和37℃保存48小时过程中分别下降了0.27 Log、0.14 Log和0.56 Log,相当于下降到原病毒滴度的53.8%、72.5%、29.8%，可以看出，37℃保存时RNA降解快。研究表明，ACD抗凝全血在4℃、25℃保存48小时，在37℃保存14小时,HCV RNA病毒含量下降<0.30 Log,也即病毒滴度下降至50%以上，仍可认为较为稳定。本研究发现一个较反常的现象是，ACD抗凝全血在4℃保存过程中其HCV RNA的含量均略低于25℃保存血，似乎无法解释为什么4℃放置后要比室温降解快。但Wang等[3]和Fong等[9]采用连续倍比稀释法检测室温和4℃放置5d或48h 的标本，也得到类似的结果。王露楠等[10]认为这一现象可用粒细胞释放的蛋白酶及核酸酶对病毒颗粒的降解作用来解释，因为粒细胞的裂解作用在4℃比在室温更强。勿容置疑，血浆标本若需较长期保存，应该冻存，但血浆标本短期保存时，冻存和液态保存那种更可取?此外，检测前的标本取样一般在室温条件下进行，如果标本数量多，取样过程需要5-6个小时，有时甚至需要进行多次检测，那么室温放置是否影响病毒含量?本研究表明，ACD抗凝分离的血浆在4℃或25℃继续保存7天,病毒滴度分别下降了0.15 Log和0.60 Log,相当于下降到原病毒滴度的70.9%和25.1%。25℃保存时RNA降解较快。分离后的血浆在4 ℃保存7天，25 ℃保存3天，HCV RNA病毒含量下降<0.30 Log,也即病毒滴度下降至50%以上，这仍可认为较为稳定。Brush等[11]用半定量的方法发现，血清标本在4℃保存7天HCV RNA含量无明显降低。Gessoni等[12]发现，4℃放置7天的血浆(5.025 Log)，比4℃ 0天时(5.492 Log)下降0.467 Log。Traband等[13]发现，于密闭SST管分离后的血清在4℃或室温放置3天，HCV RNA均稳定，HCV RNA下降≤0.5 Log。Halfon等[14]研究表明， 4℃保存5天的血浆HCV RNA减少4.8%。本研究结果与这些结果相一致。但Halfon等[14]报告，室温保存5天的血浆HCV RNA丢失。上述结果不一致，究其原因有方法学方面的问题(标本采集、处理条件，检测方法等)，也可能与被检样本数过少有关。标本反复冻融会引起病毒RNA的降解。但标本的冻融有时又是难以避免的。那么冻融究竟有多大的影响呢?冻融多少次是可以接受的呢?本研究ACD抗凝血离心获得的血浆经过-70℃/室温反复冻融1、2、3、4次处理，与未冻融组(对照)比较，冻融1-4次标本组的病毒含量分别下降了0.09 Log,0.11 Log,0.25 Log和0.41 Log, 即血浆冻融3次HCV RNA病毒含量下降<0.30 Log,也即病毒滴度下降至原滴度的50%以上。王露楠等[3]报道反复冻融3次未发现明显差异，Halfon[14]等报道反复冻融5次，HCV RNA含量降低16%。

　　【参考文献】

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