HBeAg和P53突变在肝癌发生中的作用

     作者：马进安,马芳,邱振华　　作者单位：中南大学湘雅二医院肿瘤科, 湖南 长沙

     Roles of serum HBeAg and P53 mutation in development of hepatocellular carcinoma

　　MA JinAn, MA Fang, QIU ZhenHua

　　Department of Oncology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, China

　　【Abstract】 AIM: To study the roles of the serum HBeAg and the P53 mutation in the development of hepatocellular carcinoma(HCC).METHODS: ELISA was applied to detect serum HBeAg and PCR and direct sequencing method were used to detect the P53 mutation.The clinicopathologic characteristics were also analyzed.RESULTS: In 42 HCC cases, 20 cases(47.6%) were serum HBeAg positive, and 25 cases(59.5%) had P53 mutation.Among them, 16 cases were overlapped. HBeAg had a significant correlation with tumor count(P=0.002), degree of the tumor differentiation(P=0.025)and recurrence(P=0.026). P53 mutation was also significantly correlated with tumor count(P=0.013), capsule(P=0.046), degree of the tumor differentiation(P=0.013)and recurrence(P=0.003).There was a close relationship between serum HBeAg positivity and P53 mutation(P=0.024).The recurrence time was shorter in the patients with positive HBeAg and P53 mutation [(4.56±2.13)months, P<0.001].CONCLUTION: Serum HBeAg and P53 mutation play important roles in the development of HCC, and they imply a poor prognosis.

　　【Keywords】 hepatitis B e antigens; genes, P53; carcinoma, hepatocellular; prognosis

　　0引言

　　根据流行病学调查发现肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染密切相关. 慢性HBV感染者中HCC发生的高危性比非HBV感染人群高约200倍[1]. 我国HCC主要发生在慢性HBV感染者，HBV感染可从无症状病毒携带发展为急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎、肝硬化、HCC，其临床结局与HBV在体内演变的情况和机体的免疫应答有关[1]，鉴定体内HBV的感染状况对揭示HCC的发病机制有积极意义. 近来发现HBeAg与HCC 的复发和预后相关，是一个值得深入研究的指标. 为了解HBV HBeAg在HCC发生发展中的作用机制，我们检测血清HBeAg和HCC中P53突变，并探讨相关的临床病理因素.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　2004/2007 HBsAg阳性HCC患者42(男38，女4)例，年龄31~72岁. 挑取手术切除肿瘤组织适量立即置入液氮，其余组织送病理检查. 肿瘤组织均经病理证实. 肿瘤组织放置-80℃冰箱备用. 同时于患者术前1 wk内常规采血3 mL离心后取血清1.5 mL用eppendorf管于-80℃冰箱保存.

　　1.2方法

　　取-80℃冰箱保存的癌组织标本约0.03 g，匀浆成细胞悬液，然后按照TIANamp Genomic DNA Kit (北京天根公司提供)的说明书提取DNA. 样品储存于-20℃. HBeAg检测采用ELISA方法，由厦门新创公司提供试剂盒，按说明书操作及判断结果. 设计引物检测P53基因第7外显子249位点. 上游引物为：5′TCCTA GGTTG GCTCT GAC3′，下游引物为：5′CAAGT GGCTC CTGAC CTG3′，全长131 bp. 由上海生工协助合成. 按照Master Mix(北京天根公司提供)说明书行PCR反应. 反应条件为：94℃ 5 min;94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s, 35个循环;72℃ 5 min. 产物送上海生工协助完成纯化和测序，测序引物同PCR引物.

　　统计学处理：用SPSS 13.0统计软件包进行处理. 对计量资料用t检验，对计数资料用χ2检验(或确切概率法)分析，用LogRank检验进行复发时间分析.

　　2结果

　　2.1HBeAg与P53基因的表达情况HBeAg阳性者20例(47.6%); P53突变25例(59.5%，图1：G>T突变);HBeAg阳性同时伴有P53突变者16例. HBeAg的表达与肿瘤数目(P=0.002)、分化程度(P=0.025)、复发(P=0.026)有关;P53突变与肿瘤数目(P=0.013)、包膜(完整/不完整或无)(P=0.046)、分化程度(P=0.013)、复发(P=0.003)亦有关(表1~2). 经统计分析，HbeAg阳性16例，阴性9例，P53突变阳性16例，阴性4例，HbeAg表达与P53突变有关(P<0.05). 表1HBeAg表达与临床病理因素分析(略)表2P53表达与临床病理因素分析(略)

　　2.2复发时间分析截止至200708，随访发现复发者24例，其中HBeAg阳性者15，阴性者9例，P53突变者19例，野生型者5例，HBeAg阳性及P53突变者15例. 统计发现，HBeAg阳性及P53突变者复发时间(4.6±2.1) mo，短于HBeAg阴性及P53野生者(9.3±3.4)mo，差异有统计学意义(P<0.001).

　　3讨论

　　慢性HBV和HCV感染是慢性肝炎发展为肝硬化直至终发展为HCC的重要因素[1]. 近来研究发现，HBeAg是HCC复发的独立风险因素和预后不良指标[2-3]. HBeAg是HBV基因组前C/C区段的mRNA表达，与HBVDNA关系密切，HBeAg阳性者病毒复制活跃，传染性强[4]. P53是细胞生长周期中负调节因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关[5]. P53的突变在肿瘤发生中起重要作用，是HCC发生的重要基因因素. 我们发现，HCC患者中，有47.6%的HBeAg阳性，说明在HCC中活动性肝炎占有相当大的比例. 而长期的活动性肝炎的存在可能伴有活跃的肝细胞损伤/修复，同时各种炎症因子的大量存在，影响各种信号的传导甚至造成基因的突变，从而使HCC发生的机会增加[6]. 本组病例中，共有25例发生P53突变，占59.5%(25/42). 经统计分析发现，P53的突变与HBeAg阳性相关. 提示在乙肝相关性HCC中，HBeAg的持续阳性可能是造成P53突变，进而促使HCC发生的原因. 孙惠川等[7]发现，HBeAg阳性是术后复发的高危因素. HBeAg与肿瘤数目、分化程度、复发等临床病理因素有关.

　　HBeAg阳性的HCC患者术后复发率较高(75.0%，15/20)，提示HBeAg阳性预后较差，与孙惠川等[7]的报道相符. 同时发现，P53突变患者与肿瘤数目、包膜(完整/不完整或无)、分化程度、复发等因素有关，术后复发也较高. 李海民等[8]应用免疫组化方法，在78例HCC中有43例P53基因染色阳性，而且表明P53基因的表达与肿瘤的病理学分级、临床分期、有无肝内或门静脉转移、是否乙型肝炎有关. 提示P53基因的高表达与肝细胞肝癌预后差有关. 统计发现，HBeAg阳性和P53突变同时存在时，术后中位复发时间短于HBeAg阴性及P53野生者，患者预后较差. 提示HBeAg对HCC发生发展的影响可能通过P53基因的功能异常表达来实现.