西藏小型猪ESR基因PvuⅡ多态性与生长繁殖性能相关分析

作者：曾昭智,江涛,张锦红　　作者单位：广东药学院 实验动物中心，广东 广州 510006; 南方医科大学 实验动物中心，广东 广州

　　【摘要】目的 了解ESR基因PvuⅡ位点在西藏小型猪中的多态性分布情况;研究其在西藏小型猪上的遗传效应，为西藏小型猪生长繁殖性状的分子遗传标记辅助选择提供实验依据。方法 记录44头西藏小型猪母猪繁殖性能，并对其所产仔猪的生长性能进行测定，采用PCRRFLP方法对ESR基因PvuⅡ位点进行多态性与生长繁殖性能进行相关性分析。结果 西藏小型猪ESR候选基因PvuⅡ位点表现出多态性，为AA、AB、BB型，A、B等位基因频率特征。初产胎的产仔数在不同基因型间差异存在显著性，不同基因型间产仔数呈BB>AB>AA的趋势，初产胎和经产胎的母猪其他指标在不同基因型间差异均没有显著性。结论 提高西藏小型猪猪群ESR基因PvuⅡ位点B等位基因频率，有利于提高西藏小型母猪的产仔数。
　　【关键词】 西藏小型猪 ESR基因 多态性 生长繁殖性能 相关分析

　　Correlation analysis of the relationship between PvuⅡ polymorphisms of ESR gene and growth and reproduction traits of Tibet minipig

　　ZENG Zhaozhi，JIANG Tao，ZHANG Jinhong， GU Weiwang

　　(Laboratory Animal Center, Guangdong Pharmaceutical College, Guangzhou,Guangdong 510006;Laboratory Animal Center, Southern Medical University, Guangzhou,Guangdong 510515, China)

　　Abstract:ob[x]jective To obtain the information on PvuⅡpolymorphism distribution of ESR gene and study its genetic effect on Tibet minipigs to provide experimental evidence for molecule genetic marker selection of growth and reproductive traits. Methods Growth and reproduction traits of 44 Tibet minipigs were recorded. The PvuⅡ polymorphism of ESR gene was detected by PCRRFLP and the relationship between polymorphism and growth and reproduction performance was analyzed. Results The genotypes were AA, AB, BB with A and B were alleles. TBN(total birth number)of the primiparous sows was significantly different between different genotypes and the tendency of TBN between different genotypes was BB>AB>AA, other index between primiparous sows and parous sows showed no significant difference. Conclusion The study results demonstrated that improving allele frequency of B allele of ESR gene might be helpful to improve TBN of Tibet minipigs.

　　Key words:Tibet minipig; ESR gene;PvuⅡpolymorphisms;growth and reproduction traits; correlation analysis

　　近年来，对影响动物的经济性状(数量性状)主基因的研究成为遗传学研究的热点之一。而产仔数作为一个重要的经济性状，更是研究的重点，近期对产仔数有显著或较显著关联的候选基因雌激素受体(ESR)基因和催乳素受体(PRLR)基因研究较为突出[1]，1991年Rothschild[2]报道了猪ESR位点的Pvu Ⅱ多态性，探讨过这种多态性与生长繁殖性能间的关系。
　　由于西藏小型猪是我国优良地方猪种，产于我国青藏高原，是典型的高原型放牧猪种[3]，很难收集到关于生产性能和繁殖性能的实验数据，故对西藏小型猪功能基因与生长繁殖性能的研究还未见报道。本研究对西藏小型猪ESR基因的PvuⅡ位点多态性分析与生长繁殖性能进行相关性研究，研究其在西藏小型猪上的遗传效应，为进行生长繁殖性状的分子标记辅助选择提供依据，以提高西藏小型猪的生长繁殖性能，也为实现我国特有小型猪资源西藏小型猪的选育保种、开发利用和实验动物化提供实验依据[4]。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料

　　1.1.1 样本来源 南方医科大学实验动物中心西藏小型猪基地随机抽取44头西藏小型猪母猪采其耳组织样品，每头猪取一小块耳组织放入准备好的EP管中，用冰盒带回实验室备用。
　　1.1.2 数据收集 收集了采样西藏小型猪母猪的初产和经产胎的产仔数、产活仔数和离乳成活数以及所产仔猪的初生体质量、离乳体质量(60日龄体质量)等相关的生长繁殖数据。
　　1.2 试验方法

　　1.2.1 基因组DNA的抽提 采西藏小型猪耳组织块，切取10 mg左右的动物组织材料，用试剂盒的方法提取基因组DNA并用用1%琼脂糖凝胶电泳检测， DNA提好后保存在-20 ℃，以防DNA降解。
　　1.2.2 目的基因的扩增 引用Short[5]设计的猪ESR基因的引物：Forward primer：5’CCTGTTTTT ACAGTGACTTTTACAGAG3’，Reverse primer：5’CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG3’，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增的特异性片断长度约为120 bp,位于ESR基因的第5外显子。PCR反应体系：10 × PCR buffer(无Mg2+)：2.5 μL，Mg2+(25 mmol/L)：1.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)：0.5 μL，Primer 1(25 mmol/L)：0.05 μL，Primer 2(25 mmol/L)：0.05 μL，Template DNA：3.0 μL，Taq酶
　　(5 U/μL)：0.5 μL，去离子水：16.9 μL，共25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，然后进入如下循环(共35个)：94 ℃变性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min。循环结束后，72 ℃延伸8 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物是否在所需的长度范围内以及是否有非特异带产生。
　　1.2.3 PCR扩增产物的RFLP分析及基因型判定 酶切反应体系：buffer：2.0 μL，PCR产物：10 μL， Pvu II (10 U/μL)：1 μL，去离子水：17 μL，在37 ℃水浴中酶切消化过夜，形成3种基因型：AA基因型(120 bp/120 bp)，AB基因型(120 bp/65 bp+55 bp), BB基因型(65 bp+55 bp/65 bp+55 bp)。由于酶切后片段的分子量相差不大，故采用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行酶切产物检测，用凝胶成像分析系统扫描记录电泳图谱，统计基因型。
　　1.2.4 统计分析 根据电泳结果统计基因型的个数及基因型频率以及各等位基因的基因频率。通过计算各基因座位基因型的生长繁殖性能表型平均值，运用软件分析SPSS10.0 for Windows中单向方差分析检测各基因型生长繁殖性能的差异。多组间两两比较用LSD方法。
　　2 结果

　　2.1 PCR扩增反应结果

　　PCR扩增西藏小型猪雌激素受体基因所得产物片段为120 bp，如图1。
　　1～18示雌激素受体基因扩增产物，M为Marker(DL2000)

　　图1 雌激素受体基因PCR扩增产物电泳图(略)

　　Figure 1 Electrophoresis pattern of PCR products of ESR gene

　　2.2 西藏小型猪ESR基因PCRRFLP分析

　　扩增产物用限制性内切酶Pvu II消化，经过12%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，在凝胶成像系统照相后可观察到图2所示的图像。
　　2.3 西藏小型猪ESR基因型和基因频率统计

　　在本次所测的西藏小型猪中,基因位点同样出现了3种基因型，其中ESR基因AA型母猪有12头，基因型频率为0.273;AB型母猪有22头，基因型频率为0.500，BB型母猪有10头，基因型频率为0.227;其中A等位基因频率为0.523，B等位基因频率为0.477。
　　6为纯合子AA型; 5、7、8为纯合子BB型;1、2、3、4、9为AB型;M为Marker (DL500)

　　图2 ESR基因Pvu II酶切产物电泳图(略)

　　Figure 2 Electrophoresis pattern of Pvu IIRFLP of ESR gene PCR products in Tibetan pigs

　　2.4 西藏小型猪ESR基因扩增片断Pvu II多态性与生长繁殖性状间的关系

　　整理收集采样西藏小型猪母猪的初产和经产胎的产仔数、产活仔数和离乳成活数以及所产仔猪的初生体质量、离乳体质量(60日龄体质量)等相关的生长繁殖数据，得到西藏小型猪ESR基因座位不同基因型繁殖性能和早期生长性能数据，见表1、表2。
　　由表1、表2可以看出：在ESR基因中，初产胎的产仔数在不同基因型差异有显著性 (F=3.579,P<0.05)，不同基因型间产仔数呈现BB>AB>AA的趋势， BB基因型母猪的产仔数分别比AB型和AA型母猪多0.264头和1.400头，初产胎和经产胎的其他指标在不同基因型间差异均无显著性(P>0.05)。
　　表1 西藏小型猪ESR基因座位繁殖性能的基本统计资料(略)

　　Table 1 ESR genotypes and their reproduction performances in Tibet minipigs

　　与不同基因型间比较：*P<0.05

　　表2 西藏小型猪ESR基因座位早期生长性能的基本统计资料(略)

　　Table 2 ESR genotypes and their early growth performances in Tibet minipigs

　　3 讨论

　　3.1 ESR基因的基因型及基因频率的分布

　　从整体上来看，与其他猪种相比可以看出西藏小型猪的A等位基因频率和B等位基因频率与梅山猪接近，并且与熊统安[6]等报道的有关西藏小型猪ESR基因多态性分析的结果一致;其中A等位基因频率比莱芜猪、长白猪、大白猪低，B等位基因频率比其他大部分的地方猪种要低一些。ESR基因的A、B等位基因的基因频率很接近，都接近0.500，这也说明西藏小型猪选择压力较小, ESR基因的分布处于原始的自然状态。
　　3.2 西藏小型猪ESR基因扩增片断Pvu II多态性与生长繁殖性状间的关联性
　　在本研究中，西藏小型猪ESR基因初产胎的产仔数在不同基因型间差异有显著性 (P<0.05)，不同基因型间产仔数呈现BB>AB>AA的趋势， BB基因型母猪的产仔数分别比AB型和AA型母猪多0.264头和1.400头，初产胎和经产胎的其他指标在不同基因型间差异无显著性( P>0.05)。Rothschild[7]等用含50%梅山猪血缘的2个合成系涉及50个全同胞家系161头母猪为材料，对ESR基因进行PFLPs分析，用Pvu Il酶切PCR扩增产物后，纯合子BB母猪胎产仔数和产活仔数都比纯合子AA母猪多2.3头(P<0.01)，比所有胎次多1.5头(P<0.01)。后在PIC合成系(含大白猪血缘)发现BB比AA母猪胎产仔数和产活仔数高1.2头，所有胎次高0.9头。对上述2次试验母猪群均记录了生长速度和背膘厚，分析后发现ESR位点不同基因型性状均值间差异不显著。张淑君[8,9]等同样采用PCRRFLPs方法分析了长白与大白杂交猪、二花脸猪和大白猪的ESR位点的多态性，并分析了多态性与母猪产仔数性能之间的相关性。结果表明:ESR位点在2个品种和长白与大白杂交母猪中均存在多态性，ESR位点对产仔数的影响趋势为BB>AB>AA。本研究结果与他人报道的基本一致,但是不同的基因型间产仔数的差异没有其他人所报道的大，这主要是跟西藏小型猪的繁殖性能不高的品种特性有关。另外，西藏小型猪仔猪的初生体质量和离乳体质量在不同的基因型间差异均无显著性，这与田勇等的研究结果一致[10]，说明ESR基因多态性对生长性能的影响不是很明显，所以在考虑ESR基因对西藏小型猪生长繁殖性能的影响时，主要是考虑ESR基因对繁殖性能方面的影响，而对生长性能方面的影响可以不用考虑。
　　【参考文献】
　　[1] VINCENT A L，WANG L，TUGGLE C K，et al. Prolactin receptor maps to pig chromosome 15[J].Mamm Genome，1997，8:793-794.

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　　[4] 曾昭智，刘运忠，任丽华，等. 西藏小型猪在广州地区生长繁殖性能的研究[J].猪业科学,2006,08:76-77.

　　[5] SHORT T H，ROTHSCHILD M F， SOUTHWOOD D G，et al. Effect of the estrogen receptor locus on reproduction and production traits in four commercial pig lines [J].J Anim Sci，1997， 75(12):3138-3142.

　　[6] 熊统安，朱猛进，郭宏，等. 中国藏猪ESR 基因Pvu Ⅱ位点多态性分析[J]. 华中农业大学学报，2005，24(5):485-488.

　　[7] ROTHSCHILD M F, JACOBSON C,WASKE D, et al . The estrogen receptor locus is associated with a major gene influencing litter size in pigs[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93: 201-205.

　　[8] 张淑君，曾凡同，邱祥聘，等.母猪的两个基因位点的多态性及其与产仔数连锁关系研究[J].四川农业大学学报，2001，19( 1):73-76.

　　[9] 张淑君.猪产仔数分子标记及其效应的研究[D].四川:四川农业大学,2001.

　　[10] 田勇，李学伟，李芳琼，等. 四川省外种猪ESR 基因对繁殖及生长性状的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医，2004,10:12-14.