星形细胞肿瘤组织中核因子κB的表达与肿瘤增殖

作者：陈保东，袁先厚，江普查，陈卫国，文志华
　　【Abstract】 AIM: To evaluate the significance of nuclear factor kappa B (NFκB) p65 protein ex[x]pression and their relationship with tumor proliferation. METHODS: The ex[x]pression of NFκB p65 protein, cyclin D1 protein and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) protein in 64 cases of astrocytic tumors and 10 cases of normal brain tissue were studied immunohistochemically. RESULTS: None of the normal tissues exhibited NFκB p65, cyclin D1 protein. In contrast, 35 of 64 astrocytic tumor specimens were positive for NFκB p65 protein with a 54.7% positive rate (P<0.01), and 27 of 64 astrocytic tumor specimens were positive for cyclin D1 protein with a 42.2% positive rate (P<0.01), the labeling index of PCNA protein were 2.2%-80.5%. Normal brain tissue were negative or of low ex[x]pression for PCNA protein. The NFκB p65 protein, cyclin D1 and PCNA protein ex[x]pression were correlated to the differentiation (P<0.05).The ex[x]pression of NFκB p65 was closely related with the ex[x]pression of cyclin D1 and PCNA. CONCLUSION: NFκB p65 is a new oncogenic protein related to the astrocytic tumors. NFκB p65 upregulates the ex[x]pression of cyclin D1 and PCNA, then leads to tumor cell malignant proliferation and tumor occurrence.

　　【Keywords】 nuclear factor of kappa B(NFκB); cyclin D1; proliferating cell nuclear antigen (PCNA); astrocytic tumor; immunohistochemistry

　　【摘要】 目的： 探讨核因子κB(NFκB)在星形细胞肿瘤中的表达及其与肿瘤增殖之间的关系. 方法： 应用免疫组织化学方法检测NFκB p65, cyclin D1和PCNA在64例星形细胞肿瘤组织及10例正常大脑组织中的表达情况. 结果： 星形细胞肿瘤中NFκB p65蛋白阳性表达率为54.7%(35/64)，cyclin D1阳性率为42.2%(27/64)，PCNA LI (Labelling index)为2.2%-80.5%，10例正常脑组织中NFκB p65, cyclin D1均无1例阳性表达，PCNA 低表达或无表达. NFκB p65, cyclin D1及PCNA的表达与星形细胞肿瘤的恶性程度有关. NFκB p65表达与cyclin D1, PCNA的表达呈显著正相关. 结论： NFκB p65是与星形细胞肿瘤相关的癌蛋白，NFκB p65上调cyclin D1, PCNA的表达，致使肿瘤细胞过度增殖，从而导致肿瘤的发生.

　　【关键词】 核因子κB;细胞周期素D1;细胞增殖核抗原;星形细胞肿瘤;免疫组织化学

　　0引言

　　细胞周期失控是许多肿瘤发生发展的重要原因. 细胞周期素D1 (cyclin D1) 是细胞周期正性调节子，在细胞周期G1期发挥着重要作用. 增殖性细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 是细胞DNA合成必不可少的一种因子，能反映细胞增殖活动. 核因子κB(nuclear factor of kappa B，NFκB)是一种多向调节功能的转录因子，广泛参与许多基因的转录调控，有研究表明其在细胞增殖及凋亡中具有核心的调节作用[1]. 我们应用免疫组化技术检测星形细胞肿瘤和正常脑组织石蜡切片中NFκB p65亚单位蛋白、cyclin D1和PCNA蛋白的表达，并探讨它们之间及其与星形细胞肿瘤病理分级间的关系.

　　1材料和方法
　　1.1材料收集我院及武汉大学人民医院199502/199812经手术切除且随访资料完善的星形细胞肿瘤64(男35，女29)例. 均经病理学证实. 年龄7～78(平均43.4)岁. 按1993年WHO中枢系统肿瘤分类法分为Ⅰ级8例，Ⅱ级18例，Ⅲ级22例，Ⅳ级16例，所有病例术前均未行放化疗. 以脑外伤颅内减压手术中获得的10例正常脑组织作为对照研究.

　　1.2方法全部新鲜标本24 h内经40 g ? L-1甲醛固定，常规石蜡包埋. 4 μm 厚度的连续切片4张， 1张HE染色复查诊断，3张行免疫组化研究. 兔抗人NFκB p65 mAb, cyclin D1和PCNA mAb购自北京中山生物技术公司,SP免疫组化染色试剂盒购自福州迈新公司. 染色方法按链霉素抗生物素蛋白过氧化物(SP法)试剂盒说明书步骤进行，以PBS代替一抗作为阴性对照. 用已知阳性切片作阳性对照. NFκB p65亚单位以细胞质、细胞核均出现棕黄色颗粒为阳性细胞，在高倍视野下记数1000个细胞. 阳性细胞数占全部肿瘤细胞数比例≥5%为阳性表达，<5%为阴性表达. cyclin D1以胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，在高倍视野下记数1000个细胞. 阳性细胞数占全部肿瘤细胞数比例≥10%为阳性表达，<10%为阴性表达. PCNA以胞核出现棕黄色颗粒或棕褐色为阳性细胞. 对每例切片，均随机观察5个高倍视野(×400),记数阳性细胞总数，用标记指数(Labelling Index, LI)表示,即LI=(阳性细胞数/计数细胞数)×，并取平均值定义为肿瘤的PCNA LI.

　　统计学处理：采用SPSS10.0统计软件进行t检验，方差分析，χ2检验及Spearman等级相关分析.

　　2结果

　　2.1NFκB p65蛋白的表达在星形细胞瘤组织中NFκB p65免疫组化阳性染色为细胞质和细胞核均出现棕黄色颗粒(Fig 1A)，64例星形细胞瘤中NFκB p65阳性率54.7%. 低度恶性星形细胞瘤(Ⅰ~Ⅱ)NFκB p65阳性率34.6%，高度恶性星形细胞瘤(Ⅲ~Ⅳ)NFκB p65阳性率68.4%，两者有显著性差异(χ2=7.12, P<0.01);NFκB p65阳性率Ⅰ~Ⅳ级瘤随着星形细胞肿瘤级别的增加而增加(χ2=12.23, P<0.01). 正常脑组织中未见NFκB p65阳性染色(Tab 1).

　　2.2cyclin D1蛋白的表达cyclin D1免疫组化阳性细胞为胞核着色(Fig 1B)，64例星形细胞肿瘤中cyclin D1的阳性表达率42.2%(27/64)，正常脑组织未见cyclin D1阳性染色. 在高、低度恶性星形细胞肿瘤组织中cyclin D1的表达差异显著(χ2=9.46, P<0.01). Ⅰ~Ⅳ级星形细胞肿瘤相邻级别之间cyclin D1阳性率有显著性差异(χ2=10.55, P<0.05, Tab 1).

　　2.3PCNA蛋白的表达PCNA免疫组化阳性细胞为胞核着色(Fig 1C)，64例星形细胞肿瘤中均有不同程度PCNA的阳性表达，PCNA LI 2.2%-80.5%，正常脑组织未见PCNA阳性染色. 在高、低度恶性星形细胞肿瘤组织中PCNA的表达差异有显著性意义(t=12.85, P<0.05). Ⅰ~Ⅳ级星形细胞肿瘤相邻级别PCNA阳性率之间差异有显著性意义(F=2.162, P<0.05, Tab 1).

　　2.4NFκB p65表达与cyclin D1, PCNA表达的关系在35例NFκB p65蛋白阳性者中，cyclin D1蛋白表达阳性例数为23例，29例NFκB p65蛋白阴性者中，cyclin D1蛋白阳性例数2例，cyclin D1的表达与NFκB p65异常表达密切相关(χ2=27.08, P<0.01)， 且两者之间存在着正相关关系(r=0.650, P<0.01). PCNA LI与NFκB p65表达也存在着正相关关系(r=0.544, P<0.01).

　　表1NFκB p65,cyclin D1和PCNA在脑星形细胞肿瘤中表达(略)

　　Tab 1ex[x]pression of NFκB p65, cyclin D1 and PCNA in astrocytic tumors(略)

　　图1星形细胞瘤Ⅳ级免疫组化染色(略)

　　Fig 1Glioblastoma mutiforme(略)

　　3讨论

　　核因子κB是1986年Sen和Baltimore首先从B淋巴细胞核抽提物中检出的，在大多数细胞中，常见的二聚体是p50/ RelA异源二聚体. 这些二聚体通过与抑制蛋白IκB直接结合形成无活性的三聚体存留于胞质，活化后二聚体进入细胞核，作用于靶基因，诱导相关基因的表达. 目前发现在很多肿瘤如白血病、淋巴瘤、大肠癌、前列腺癌及星形细胞肿瘤等肿瘤中均存在着NFκB的异常活化[2-4]，但其与人脑肿瘤组织病理之间的关系尚不明确. 本研究表明,星形细胞肿瘤中NFκB p65阳性率为54.7%，而正常脑组织中NFκB p65免疫组化结果均为阴性，说明NFκB p65蛋白异常表达与胶质恶性程度密切相关，表明NFκB在星形细胞肿瘤的发生中发挥重要调节作用，是一个与星形细胞肿瘤相关的癌基因蛋白.

　　肿瘤是一种细胞周期病，细胞周期不同时相间存在关键的调控点，由于细胞表现为增殖失控，对G1期S期间的调控点的研究就更为重要[5]. cyclin D1基因表达的异常在许多肿瘤细胞中存在, cyclin D1的过量可使细胞失去对生长因子的依赖，导致肿瘤的发生;在乳腺癌、食管癌、喉癌、肺癌、以及肝癌等多种肿瘤中均发现cyclin D1的基因扩增及过表达，且cyclin D1的过表达与肿瘤的复发、淋巴结转移以及预后不良相关[6, 7]，我们发现在星形细胞肿瘤中cyclin D1蛋白表达率为42.2%，其与肿瘤的病理分级密切相关，并随着肿瘤恶性程度的增加，阳性率也增加，证实了cyclin D1也是星形细胞肿瘤的癌基因之一. PCNA是一种非组蛋白核蛋白，是DNA合成所必需的DNA多聚酶的辅助蛋白，可使多聚酶酶活性增加几百倍，有报道表明PCNA与肺癌的生长和恶性行为有关[8]，与少枝胶质星形细胞瘤和室管膜瘤的预后密切相关[9, 10]，PCNA LI与胶质瘤的病理分级存在着正相关关系[11, 12]，我们发现在星形细胞肿瘤中PCNA LI为2.2%-80.5%，其与肿瘤的病理分级密切相关并随着肿瘤恶性程度的增加，PCNA标记指数也增加，说明PCNA LI可以反映星形细胞肿瘤的增殖行为和恶性程度，对肿瘤的预后判断有一定的意义.

　　NFκB 活化通过作用于cyclin D1/CDK/CKI系统进行细胞增殖的调控. 凝胶迁移率试验分析(EMSA)证实NFκB在cyclin D1启动子上有3个结合位点. NFκB活化后通过促进cyclin D1表达、pRB高磷酸化及G1/S期转换而加速细胞周期行进，并抑制细胞分化. 近研究表明在恶性胶质母细胞瘤出现NFκB 构成性活化并通过cyclin D1作用于肿瘤的细胞周期，但是恶性转化具体机制尚不清楚[13]. 本试验结果证实星形细胞肿瘤中NFκB 与cyclin D1具有明显的正相关性(r=0.650, P<0.01)，与PCNA LI具有明显的正相关性(r=0.544, P<0.01)，证实NFκB的活化作用于cyclin D1及PCNA导致细胞周期调节失控，细胞表现为自主分裂和无限增殖，这在肿瘤发生中具有重要意义，进一步提示在脑星形细胞瘤中联合检测这两种指标有助于判断肿瘤的预后，并指导临床治疗.

　　NFκB, cyclin D1都可能成为肿瘤治疗中新的靶基因. 肿瘤治疗中的细胞因子、放疗和化疗药物都因NFκB的激活而降低他们的治疗效果[14]，因而不同水平、不同层次的抑制NFκB, cyclin D1和PCNA在一定程度上可抑制细胞由G1向S期过渡，改变转化细胞形态，为星形细胞肿瘤治疗提供新的思路.

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