Fbxw7通过降解c-Myc和Cyclin E诱导胃癌细胞凋亡和生长阻滞

        胃癌( gastric cancer)起源于胃壁表层的黏膜上皮细胞，其中腺癌约占90%。全世界每年大约新发胃癌100余万，中国占42%，死亡约80万，中国占35%，是胃癌发病率和死亡率高的国家之一，发病率和死亡率均是世界平均水平2倍多。Fbxw7( F-boxand WD repeat domain-containing 7；也称Fbw7、SEL-IO、hCdc4和hAgo）是Skpl-Cull-F-box( SCF)类 泛素连接酶E3复合体中特异性识别底物的关键因子，能够靶向降解CyClin E，c:-Myc:，c -Jun和Notch等癌蛋白，是一种广泛的抑癌基因。在许多种人类恶性肿瘤中都发现Fbxw7表达缺失，同时，研究证窦下调Fbxw7基因表达可以促进肿瘤细胞增殖，而在肝癌细胞中过表达Fbxw7可以诱导细胞凋亡。本实验初步探讨Fbxw7在胃癌发生、发展中的作用，为胃癌治疗提供新的思路。

        1 材料与方法

        I.I材料
        I.I.I组织标本 胃癌及对应癌旁组织来源于福建省立医院手术切除标本共20例，其中男14例，女6例，年龄31 - 68( 50+3.5)岁。所有患者术前均未行放、化疗，所有组织标本经术后病理学证实为胃腺癌。所有标本丁术中离体30 min内取材，经10%福尔码林溶液同定，石蜡包埋、切片备用。

        1.1.2细胞培养 胃腺癌细胞系MCC-803和A2521均购白于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，MGC-803表达Fbxw7相对较低，A2521表达Fbxw7相对较高。细胞培养于含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100I_Lg/mL链霉素的DMEM培养基中，置于37 0C、50 mL/L C07细胞培养箱中，饱和湿度下培养。稳定传代2-3代后，取对数生长期细胞进行实验。

        1.1.3 主要试剂 DMEM培养基、青／链霉素和0.25%胰蛋白酶购白CJib{:o公司；胎牛血清购白浙江天杭生物科技有限公司；二甲基亚砜( DMSO)和苯甲基磺酰氟( PMSF)购白Sigma公司；p~巯基乙醇购白Boehinger公司；ECL化学发光试剂盒和PVDF膜购白Millipore公司；BCA蛋白定量试剂盒购白Pierc:e公司；质粒小提试剂盒和慢病毒包装试剂盒购白 QIAGEN公司；Fbxw7抗体购白Abcam公司；c:-Myc和CvClin E抗体购白CST公司；|3-ac:tin抗体购白Santa Cruz公司；免疫组织化学试剂盒购白北京中杉金桥生物技术有限公司；噻唑蓝(MTT)购白Roc:he公司。

        1.2方法
        1.2.1免疫组织化学染色对石蜡块进行4um连续切片制片。经过脱蜡过程后，进行热抗原修和内源性过氧化物酶灭活，100 mUL山羊血清封闭，1:100稀释的Fbxw7 -抗40C孵育过夜。以PBS取代一抗为阴性对照。滴加生物素标记的山羊抗鼠二抗l：作液，滴加辣根酶标记的链霉卵白素l：作液，滴加DAB娩色，苏木苏轻度复染，梯度脱水至透明。艟微镜下观察、成像系统拍照。采用染色强度联合阳性细胞百分比进行评分：染色强度分为4等级：0分，阴性；1分，弱阳性；2分，中度；3分，强阳性；阳性细胞百分比分级如下：阳性细胞≤5%为0分，6% - 25%为1分，26% - 500/c为2分，51- 75%力3分，>75%为4分。染色强度和阳性细胞百分比评分相乘≥1分则认为Fbxw7蛋白阳性表达。

        1.2.2质粒转染Fbxw7过表达质粒、空白对照质粒(EV)、Fbxw7 shRNA和阴性对照shRNA( NT-shRNA)南Kanae Yumimoto教授惠赠(Department of Molec:u-lar and Cellular Biology, Medic:al Institute of Bioregula-tion，Kyushu University)。质粒转染按照Effec:tene@Transfec:tion Reagent说明书操作。
        1.2.3 Western hlot检测取转染48 h后的细胞，弃培养基，使用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5 h，40C下110 V电压湿转1.5 h。5%脱脂奶粉(TBST溶解)室温封闭，加入1:1 000稀释的Fbxw7、c:-Myc:和CvClin E抗体以及1:10 000稀释的(3-actin抗体，40C孵育过夜，加入适当(1:2 500)浓度的二抗，室温孵育2h。暗室内浸入ECL液艟色，并使胶片曝光，全自动X光洗片机洗斤。

        1.2.4 MTT法检测细胞增殖离心、收集转染12 h的细胞，调节细胞密度约为2x105/mL，以200 ILU孔接种于96孔板。96孔板的左上孔设为空白孔，每组设6个复孔。加5 mg/mL MTT溶液20 yL/孔，继续避光培养4h，弃上清，加DMS0 150I_LL/孔，37 0C振摇孵育20 min至颗粒溶解。酶标仪上测定各孔490 nm的吸光度( OD490)，分析各组细胞活性。 1.2.5流式细胞术细胞转染48 h后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞1次，再用胰酶消化液解离细胞，1 500 r/min离心5 min，弃上清液收集细胞。用PBS重新悬浮细胞，并计数。取1- Sx105细胞悬浮液，1 500 r/min，5 min离心后弃上清液，加入500 IiL的1×结合缓冲液。加入5 111 Annexin V-FITC，再加入10I_L1碘化丙啶，移液器轻轻吹打混匀。室温下避光反应5 - 15 min，在th内进行流式细胞仪检测。

        1.3统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以x+s表示。根据数据处理的不同方法及统计学处理的不同要求，选用方差分析或f检验进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

        2 结果
        2.1 Fbxw7茌胃癌组织中低表达 免疫组织化学法检测Fhxw7在20例胃癌及对应癌旁组织中的表达水平，结果发现Fbxw7在胃癌组织中的表达水平( 1.24+0.23)艟著低于对应的癌旁组织(7.68+2.13)(n=20, t=8.456. P=0.004); Fbxw7蛋白主要定位在细胞质和胞膜中（图1）。

        2.2过表达l'bxw7下调c-Mvc和CVclin E蛋白表达
        采用Fbxw7过表达质粒转染MGC-803细胞，Weslern blol检测转染48 h后的MCJC-803细胞中Fbxw7及其靶蛋白c-Mvc和CVclin E的表达，结果显示Fbxw7蛋白表达明湿升高并伴随c-Mvc和Cyclin E明显降低（图2）。

        2.3 过表达Fhxw7降低细胞增殖能力采用MTrl'法连续检测l'bxw7过表达细胞的增殖能力，结果示相对丁空质粒(EV)转染细胞组，Fbxw7过表达后MGC-803细胞增殖能力显著减弱（P<0.05，图3）。

        2.4过表达Fhxw7诱导细胞凋亡
        MGC803细胞转染Fbxw7过表达质粒48 h后，采用流式细胞术检测细胞凋亡变化，结果屁示Fhxw7过表达组细胞凋亡较空质粒(EV)组著增加(P<0.05，图4)。

        2.5敲低Fbxw7导致c-Mvc和Cyclin E蛋白蓄积
        Fbxw7 shRNA转染A2521细胞48 h后，Weslernblol检测Fbxw7及其靶蛋白c-Myc和Cyclin E昀表达，结果显示Fbxw7蛋白表达明显降低）f二伴随c-Mvc和CVclinE蛋白蓄积（图5）。

        2.6敲低Fbxw7增强细胞增殖能力
        采用MTT法连续检测敲低l'bxw7对细胞增殖能力的影响，结果显示相对丁阴性对照( LXirr_ShRNA)转染细胞组，敲低Fhxw7后A2521细胞增殖能力屁著增强（P<0.05，图6）。

        2.7敲低Fhxw7减少细胞凋亡
        AZ521细胞转染l'bxw7 shRNA 48 h后，采用流式细胞术检测细胞凋亡变化，结果显示Fbxw7 shRNA组细胞凋亡较阴性对照CNT-shRNA)组屁著减少（P<0.05，图7）。

        3讨论
        靶蛋白的泛素化是南功能连续的二个酶介导的：泛素激活酶(EI)、泛素载体蛋白酶(E2)和泛素连接酶(E3)。泛素化底物被26S蛋白酶体选择性的识别和降解口1。SCF类E3复合体是泛素连接酶(E3)中的一类，南环指蛋白(ring-box 1，Rbxl；也称Rocl和HrLI)、支架蛋白(cullinl，Cull)、衔接蛋白(S-phasekinase-associaled prolein l，Skpl)和一个F-box蛋白组成，其中F-box蛋白类决定底物特异性。Fbxw7是r-box蛋白家族的一员，对漂亮新小杆线虫进行遗传分析时，Fbxw7怍为LIN-12介导（Nolch介导）信号通路的负调节因子苗‘次被发现。Fbxw7在哺乳动物细胞中也与Nolch家族蛋白类相互作用，促进其泛素依赖的更新训。而且Fbxw7靶向降解数个控制哺乳动物细胞周期进程的蛋白，包括CyclinE、c-Myc和 c-J un，同时SREBPs (slerol regulalory elemenL bindingprolein)、mrl'OR (mammalian LargeloI rapamycin)乖UPGC-Ia（PPAR^y-coacLivalor-1a）等,自接参与细胞周期调控的蛋白也通过Fhxw7靶向降解。 CVclinE、c-Myc、c-J un和Nolch都是原癌基因的产物，Fbxw7能促进这些癌蛋白的降解，因此被认为是一种广泛的肿瘤抑制因子。Yakohori等发现Fbxw7低表达与胃癌淋巴结转移、肿瘤大小和不良预后相关，而且Fbxw7低表达合并p53突变的胃癌患者具有不同的预后不良，提示协同破坏p53和Fbxw7促进肿瘤患者预后不良。另外6%前列腺癌中存在 Fbxw7基因位点修饰，Fbxw7业型差异表达与前列腺癌高分期和复发呈负相关n1。另外一个团队也证实Fhxw7突变导致的Cyclin E高表达在胰腺癌发展中发挥决定性作用。这些结果提示Fbxw7在多种人类肿瘤发生中作为肿瘤抑制基因发挥功能。本研究应用免疫组织化学技术发现Fhxw7在胃癌组织中的表达明湿低丁对应的癌旁组织，这与之前的相关报道一致。在许多种人类恶性肿瘤中都发现Fbxw7表达缺失，包括急性T细胞型淋巴细胞白血病、胆管上皮癌、胰腺癌、肝癌、食管鳞状细胞癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌和子宫内膜癌=3l。p53可以直接调控Fbxw7表达，但0- 770/c的剐崮组织中存在p53突变，而且研究表明60/c胃癌组织中存在Fbxw7基因突变。以上两种机制可能是导致胃癌中Fbxw7低表达的原因。Fhxw7调控多种癌蛋白的表达，但在胃癌中其具体的调控靶点和相关通路尚不清楚，国外研究证实应用特异性Fhxw7 siRNA下调Fbxw7基因表达可以导致c-Myc和Cyclin E蓄积并促进胃癌细胞增殖。

        本研究在胃癌MGC-803细胞中过表达Fhxw7，结果发现Fbxw7下调c-Mvc和CVclin E蛋白表达水甲，抑制细胞增殖并诱导细脆凋亡，而在A2521细胞中转染Fbxw7 shRNA后，导致c-Mvc和Cyclin E蛋白蓄积，并伴随细胞增殖能力增强和凋亡减少。c-Myc在有丝分裂信号通路和细胞生长过程中发挥重要作用，并参与细胞凋亡信号通路，CVclin E是细胞周期调控的关键组分，两者在胃癌组织中都表达失调。结合以上结沦推测Fbxw7在胃癌中作为肿瘤抑制因子发挥功能，其可能通过调节c-Myc和Cyclin E的表达介导胃癌细胞的增殖和凋亡调控。