悬浮培养结肠癌细胞球具有上皮间质转化特征

　　肿瘤干细胞学说认为，肿瘤中一小群具有干细胞特征的细胞维持着肿瘤的自我更新和分化，参与了肿瘤的侵袭、转移等生物学行为，这部分细胞被称为“肿瘤干细胞("CSC)”或“肿瘤起始细胞(TIC)。可以预见，CSC将是非常关键的肿瘤治疗的靶细胞。但CSC所占比例极低，极难获得足够的CSC进行深人研究。因此寻找高效的培养、富集CSC的方法具有重要的科学价值和现实需要。研究表明上皮间质转化(EMT)在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，但是CSC与EMT关系的研究却少有报道，进一步揭示CSC与EMT的内在机制将有利于肿瘤的诊疗。我们将人结肠癌DLD-1细胞株在无血清培养基(SFM)中培养形成DLD-1细胞球(DLD-S)，并探讨具有肿瘤干细胞特征的球细胞发生EMT与其迁移、侵袭等恶性行为之间的联系。 　　

　　材料和方法 　　

　　1.材料:人结肠癌DLD-1细胞株由华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科实验室提供;细胞外基质(ECM)胶购自Sigma公司;逆转录试剂盒及实时定量聚合酶链反应(Real-timePCR)试剂盒购自TaKaRa公司;Transwell小室购自BD公司;赫钙蛋白(E-cadherin),波形蛋白(Vimentin、紧密连接蛋白(ZO-1),Snail抗体购自CST公司;CD133抗体购自美天妮公司;CD166、富含亮氨酸重复序列G一蛋白偶联受体5(LgrS)抗体购自Santa公司;胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司;引物由Invitxogen公司合成。 　　

　　2.细胞培养及实验动物:DLD-1细胞在含10%FBSRPMI1640培养基中于370C,5%CO:饱和湿度条件下培养。SFM配制:DMEM/Fl2培养基中加人10},g/L表皮生长因子、10},g/i碱性成纤维生长因子、0.4%牛血清自蛋白、Sm扩L胰岛素、20l0B273.Real-timePCR;Trizol法提RNA及逆转录、Real-timePCR步骤按说明书操作，每孔设3复孔序列如下:5-GCCCTGCCAATCCCGATG.1AA-3(E-cadherin上游)，5-GGGGTCAGTATCAGCCGCT-3(E一cadherin下游);5-TGAGGCAGCTCACATAATGC-3(Zi)一1上游)，5-GGGAGTTGGGGTTCATAGGT-3(Z0-1下游沙;s一CTTCAGAGAGAGGAAGCCGAAAA-3(Vimentin上游),5-CCGTGAGGTCAGGCTTGGAAA-3(Vimentin下游);s-CCAGACCCACTCAGATC}T-CAAGAA-3(Snail上游)，s-GGCAGAGGACA-CAGAACCAGAAAA-3(Snail下游);s-ACCGACT-GAGACCCAACATC-3(CD133上游)，5-GACCG-CAGGCTAGTTT"fCAC-3(CD133下游);s-CGCAAT-GCAACAGGAGACTA-3(CD166上游)，5-CCA-CAGTTGCATTCGTGCTA-3(CD166下游);s-CTCT-TCCTCAAACCGTCTGC-3(Lgrs上游)，s-GATCG-GAGGCTAAGCAACTG-3(L护下游)5-GGGGAGC-CAAAAGGGTCATCATCT-3「甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游l，5-GACGCCfGCffCACCACCTTCT-T(>-3(GAPD只下游)。 　　

　　4.Transwell侵袭实验:ECM胶用预冷无血清培养基按1:9稀释。Transwell小室中每孔加人稀释后ECM胶40闪，}7℃孵育sh后每孔加70闪无血清培养基，370C孵育30min后吸弃培养基。每孔加含有2x105细胞的细胞悬液200闪于上室，下室加人600闪含20%FBS的培养基，约20h后用0.1%结晶紫乙醇溶液固定1sruin，棉签擦掉上曰细胞。200倍显微镜下随机取6个视野，观察计数细胞行统计学分析。Transwell迁移实验:不用ECM胶，其余步骤一致。 　　

　　5.软琼脂克隆形成实验:配制1.2%下层胶和0.6%上层胶，6孔板下层培养基为1.5ml(0.75ml含200}oFBS的2xRPMI1640培养基+0.75ml1.2%下层胶)，待下层胶凝固后加人1ml上层培养基((0.5ml含20%FBS的2xRPMI1640培养基+0.5ml0.6%上层胶+5000个细胞)，待上层胶凝固后放人培养箱中培养lOd后在显微镜下计数细胞数)50的克隆，并进行统　　计学分析。 　　

　　6.裸鼠皮下成瘤实验:消化调整细胞浓度，PBS重悬后，每点注射200闪含有1xlOG个细胞为宜，注射后夹闭针孔巧s防止液体流出。每天观察记录裸鼠状态和肿瘤情况，60d后处死裸鼠，对瘤体行后续相关分析7.}esternblot实验:将样本测蛋白浓度后，取50},g总蛋白上样电泳，取出凝胶切取目的条带，用蒸馏水冲洗，取聚偏氟乙烯(PVDF)膜用甲醇浸泡数秒后和滤纸一同浸泡于电泳缓冲液中，后按照条件转膜。 　　

　　转膜后用含5%r脱脂牛奶TEST封闭液浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2h，取稀释后一抗浸泡孵育PVDF膜，4℃过夜次日孵育二抗后，显色曝光获得条带，扫描胶片获得灰度值行统计学分析结果
　　1.细胞球的形成及球细胞自我更新与分化:肿瘤细胞在SEM中悬浮培养可形成具有干细胞特征的细胞球，第5天开始可以观察到典型的DLD-S悬浮细胞球，此后细胞球逐渐增大增多。将其消化后再次接种于SFM中，5d左右仍可形成细胞球，形态与之前相同且能持续传代，提示DLD-S具有自我更新能力。将DLD-S接种于含10%FBS的培养基中，细胞贴壁生长形态与DLD-1细胞无明显差异，显示DLD-S细胞具有分化能力。 　　

　　2.DLD-S细胞中富集更多的CD133十细胞:CD133是结肠癌CSC经典的标志之一，我们采用流式细胞术分析了DLD-S及DLD-1细胞中CD133表达，结果显示DLD-S中CD133+比例为(2.90士0.20)%,DLD-1中为(0.9010.05)%，差异有统计学意义(P<0.05)0显示采用SFM培养可以富集CSC。 　　

　　3.DLD-S具有更强的侵袭、转移能力:我们通过Transwell法检测了2种细胞的迁移、侵袭能力。结果显示:在Transwell迁移实验中，每个视野DLD-1细胞数为(112士5)个，而DLD-感为(206士8)个，差异有统计学意义(P<0.05);Transwell侵袭实验中每个视野DLD-1细胞数为(59土5)个，DLD-S为(108士9)个，显示DLD-S的侵袭及转移能力明显增加(P<0.05)}
　　

　　4.DLD-S具有更强的体内外成瘤能力:分别用软琼脂克隆形成实验及裸鼠皮下成瘤实验研究两种细胞体内和体外的成瘤能力差异，结果显示，DLD-s比较DLD-1具有更强的克隆形成能力，表现为克隆数目明显增多，克隆明显增大(克隆数为698士21比172士7,P<0.05)。裸鼠皮下成瘤实验显示，在皮下注射60d后麻醉处死裸鼠，解剖瘤体分析发现DLD-S具有更强的体内成瘤能力。表现为瘤体更大(P<0.05)5.DLD-S高表达肿瘤干细胞及间质细胞基因:采用Real-tunePCR及Westernblot检测了EMT及结肠癌CSC相关基因信使RNA(mRNA)及蛋白质表达结果显示，DLD-S高表达如CD133,CD166,Lgr5结肠癌CSC基因(P<0.05)。虽然上皮基因E-cadherin高表达，但是ZO-1表达却降低，同时间质基因Vimentin,Snail表达上升，提示DLD-S已发生EMT(P<0.05,图1,2)。 　　

　　讨论
　　结肠癌的转移、复发是制约临床疗效的关键因素，对肿瘤转移、复发机制的深入研究对于肿瘤的治疗有重要意义。研究表明肿瘤中一小部分具有十细胞特征的CSC将是非常关键的治疗靶点。目前主要通过一些细胞表面标志如CD133,CD44,CDI66,LgrS,EpCAM,ALDHl等及是否能够排出Hoechst33342染料来分选收集CSC}4-11J。但结肠癌4JC所占比例相当少，这制约了结肠癌CJIa的提取和纯化，严重影响了对C}C的进一步研究而SFM培养能够富集CSC，可在一定程度上解决上述难题〔CSC具有强大的自我更新与分化能力，在体内外具有更强的成瘤能力。本研究结果显示，SFM培养收集的DLD-S具有更强的自我更新与分化能力，具有CSC,的特征。我们采用肿瘤研究中经典的裸鼠皮下成瘤和软琼脂克隆形成实验来验证DLD-S细胞的体内、体外成瘤能力，结果显示，比较DLD-1细胞，DLD-S细胞表现出更强的体内外成瘤能力，这与之前其他研究者的报道相符。肿瘤的侵袭、转移是其恶性行为的重要体现，我们通过『1ranswell迁移、侵袭实验证明rDLD-S细胞具有更强的侵袭、转移能力，符合结肠癌CSC的特点。为了证明DLD-S与CSC的相关性特征，我们采用Real-timeYCP},Westernblot的方法检测了DLD-S细胞中C:SC基闪的表达，结果显示，随着DLD-S恶性行为的增加，细胞中的CD133,CDI66,Lgr}表达也增加了;另外，流式细胞术分析显示DLD-S中CD133十细胞明显增加。它说明DLD-S中确实富集了结肠癌CSCEMT是指细胞极性丧失、细胞间连接分子降解、细胞骨架重塑获得更强的迁移、运动能力。伴随着仁皮细胞标志如E-cadherin,ZO-l的表达下降，而间质细胞标志如Vimentin,Snail表达增高。研究显示肿瘤细胞发生EMT可以明显提高其侵袭、转移等能力，且进一步表达CSC相关基因，提示EMT可能参与了肿瘤的进展。根据肿瘤十细胞理论，CSC介导了肿瘤的一系列恶性行为，因此进一步揭示CSC与E1}}IT的关系具有重要的科学价值，而国内外对此报道还相对较少。有鉴于此，我们检测了DLD-S的EMT相关基因表达情况，结果显不随着肿瘤转移、侵袭、成瘤能力增加及CD133,CD166,LgrS的表达升高，DLD-S中间质基因Vimentin和Snail表达明显增加，上皮基因ZO-I表达下降，提示DLD-S细胞已经发生了EMT另外，可见在DLD-S中E-cadherin表达也明显增加，E-cadherin被认为是EMT中极重要的调节因子，有研究结果显示:E-cadherin高表达可抑制EMT，导致肿瘤细胞恶性行为下降的报道。虽然E-cadherin的表达与我们的预期不符，但是肿瘤CSC与普通肿瘤细胞的异质性大，我们认为在结肠癌CSC中E-cadhei}in可能还不是独立的介导细胞侵袭、转移等恶性行为的基因，在CSC中可能还有其他基因在促进CSC恶性行为的同时对E-cadherin进行调控导致其表达增加。Nam的研究也从侧面证明了我们的观点‘al我们通过在SFM中培养DLD-1细胞获得细胞球，证实了球细胞具有更强的侵袭、转移、成瘤能力;且CSC细胞数量增加，相关CSC基因表达增加。证明了DLD-S中确实富集了结肠癌CSC，具有肿瘤干细胞的特征。同时，我们检测了球细胞中EMT相关基因表达，可见伴随着上皮细胞基因ZO-1的下降，间质细胞基因表达上升，提示细胞发生了EMT虽然上皮基因E-cadherin表达上升，但是考虑到CSC与普通肿瘤细胞的异质性，同一基因在此两类细胞中可能发挥完全不同的功能，结合体内外实验研究结果，我们认为DLD-S细胞已经发生了EMT。本研究结果显示，无血清悬浮培养结肠癌所形成的球细胞，具有肿瘤干细胞的特征，其转移相关特性与EMT有着密切的联系。 　　

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