过氧化物酶体增殖活化受体-α激活对HepG2细胞脂肪变性及血红素加氧酶-1表达的影响

         过氧化物酶体增殖活化受体-α及血红素加氧酶-1在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)进程中起关键作用,均能阻止NAFLD的发生及发展。但在NAFLD的发生和发展中PPAR-α与HO-1的关系究竟如何?PPAR-α与HO-1的激活是否可以通过上调PPAR-α的表达进而抑制肝细胞脂肪变性?相关研究目前鲜见报道。本实验利用油酸诱导人肝癌HepG2细胞脂肪变性为模型,初步探讨了PPAR-α与HO-1的表达在肝细胞脂肪变性中的作用。 　　
         材料与方法 　　
         一、主要试剂 　　
         细胞来源:HepG2细胞由山西长治医学院肝病研究所惠赠。DMEM培养基购自美国Gibco公司,胎牛血清购自杭州四季青公司,OA购自天津风船化学试剂科技有限公司,油红O购自上海化学试剂公司,甘油三酯(TG)试剂盒及蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程公司,非诺贝特购自湖北健源化工有限公司,HO-1兔抗人多克隆抗体、PPAR-α兔抗人多克隆抗体及即用型SABC免疫组织化学试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司,TRIZOL试剂盒购自美国invitrogen公司,SYBRGreenMaster(ROX)购自德国Roche公司。 　　
         二、实验方法 　　
         1.HepG2细胞培养及脂肪变性模型的建立:HepG2细胞置于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基,在pH7.2,37℃,5%二氧化碳孵育箱中培养至铺满培养瓶底80%~90%时,胰蛋白酶-EDTA消化2min,无菌吸管吹打成细胞悬液,调整细胞密度至5×10的7次方个/L接种于放置了无菌盖玻片的6孔培养板用于免疫细胞化学染色及细胞内TG检测,或调整细胞密度至2×10的8次方个/L接种于25ml培养瓶用于mRNA抽提。参照Cui等的研究,HepG2细胞培养于96孔板中,分别加人含不同浓度OA的培养基,噻唑蓝比色法确定诱导细胞形成脂肪变性的佳浓度,油红O染色进行鉴定。 　　
         2.实验分组:HepG2细胞培养24h后,更换无血清培养基并加人OA及不同浓度的FF继续作用24h。将细胞分为5组:⑴对照组;(2)模型组:OA0.2mmol/L;(3)5umol/L的FF模型组:OA0.2mmol/L+FF5umol/L;(4)10umolFF模型组:OA0.2mmol/L+FF10umol/L;50umol/L的FF模型组:OA0.2mmol/L+FF50umol/L。采用锥虫蓝染色法检测各实验组细胞活力。 　　
         3.细胞内TG含量检测:收集6孔板内培养好的HepG2细胞,加人细胞裂解液并震荡,冰上放置30min,待细胞充分裂解,4℃,14000r/min离心10mm,取上清液。双金鸡宁酸法检测蛋白含量,甘油名-磷酸氧化酶法检测TG的含量。 　　
         4.RT-PCR:将接种在25ml培养瓶内的细胞按Trizol试剂盒说明步骤提取总RNA;逆转录反应条件参照试剂盒说明;用β-肌动蛋白作内参照,各引物序列如下:β-肌动蛋白:上游5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′,下游5′AGCACTGTGTK忑CGTACAG-3′,扩增片段为184bp;PPAR-α引物序列:上游5′CCAGAAACCCAGAACTCAGC-3′,下游5′-ATGGCCCAGTGTAAGAAACG-3′,扩增片段为141bp,HO-1引物序列:上游5′-TCCGATGGGTCCTTACACTC-3′,下游5-TAACTGAAGCCAGCCAAC.AGA-3′,扩增片段为154bp,引物均由上海生工生物工程有限公司合成;PCR反应体系:cDNA2ul,10×缓冲液2ul,10mmol/LdNTP0.4ul,目的引物各0.2ul,5U/ulTaq酶0.2ul,DEPC水15ul;扩增过程:95℃10min预变性,然后95℃30s,58℃60s,。45个循环进行扩增;反应完成后,用内参照值对PPAR-α及HO-1mRNA原始值进行调整,计算Ct值,所检测细胞内PPAR-α、HO-1基因量=1/2。 　　
         5.免疫细胞化学染色:将6孔板内的HepG2细胞弃去培养液,4%多聚甲醛室温固定3Omin;0.1%Triton-X100处理10min;血清封闭20min;滴加抗体工作液(均1∶100稀释)4℃过夜;滴加生物素第二抗体,37℃孵育30min,滴加链酶亲和素-生物素一过氧化物酶复合物,岁℃孵育30min;二氨基联苯胺室温显色15min;苏木素轻度复染,梯度酒精脱水,中跬树胶封片。Image-Plus6.0图像分析软件进行分析,累积吸光度值代表蛋白的表达量。 　　
         6.统计学方法:采用SPSS13.0软件,数据以均数±标准差表示,采用单因素方差分析,以LSD-t法进行组间比较,P<0.05为差异有统计学意义。采用Pearson直线相关进行相关分析。 　　
         结果
　　1.HepG2细胞脂肪变性情况:对照组细胞边缘清晰,细胞内未见明显橘红色脂滴,模型组OA诱导浓度为0.2mmol/L,诱导24h的HepG2细胞油红O染色见细胞内有大小不等的橘红色脂滴聚集,表明成功建立了HepG2细胞脂肪变性模型。 　　2.油酸诱导的HepG2细胞内TG含量及非诺贝特的干预作用:各实验组细胞经0.5%锥虫蓝染色计数细胞存活率均大于95%。HepG2细胞内甘油三酯含量(样本数均为6)对照组为(185.03±12.68)mg/g、模型组为(379.98±23.19)mg/g,模型组油酸诱导的HepG2细胞内TG含量显著增高,与对照组比较,t=24.385,P<0.01,差异有统计学意义。非诺贝特5umol/L组为(294.00±19.80)mg/g、非诺贝特10umol/L组为(250.33±9.96)mg/g、非诺贝特50umol/L组为(196.99±9.14)mg/g,非诺贝特5、10、50umol/L组与模型组比较,TG含量均明显降低,且下降程度呈FF浓度依赖性t值分别为10.747,16.200,22.873,F=148.555,P值均<0.01。 　　
         3.脂肪变HepG2细胞中PPAR-α及HO-1mRNA的表达及FF的影响:正常HepG2细胞中PPAR-α及HO-1mRNA表达水平较高,而OA组PPAR-α和HO-1mRNA的表达明显下降(t值分别为0.583及0.637,P值均<0.01),PPAR-α激动剂FF作用组与OA组相比,PPAR-α及HO-1mRNA的表达水平同步升高(F值分别为177.637及74.768,P值均<0.01),二者呈正相关(r=0.993,P<0.01),且均呈现FF浓度依赖性。 　　
         4.脂肪变HepG2细胞中PPAR-α及HO-1蛋白的表达及FF的影响:在正常HepG2细胞,PPAR-α主要在细胞核表达,HO-1以胞质表达为主,显色呈现明显的棕色颗粒。与正常对照组相比,OA组PPAR-α及HO-1蛋白的表达量明显下降(t值分别为1.382及0.967,P值均<0.01),与OA组相比,随着FF浓度增加,PPAR-α及HO-1蛋白的表达均升高(F值分别为120.764及119.903,P值均<0.01),二者呈正相关(r=0.997,P<0.01),并呈现FF浓度依赖性。 　　
         讨论
　　目前对NAFLD发生和发展的具体机制尚不十分清楚。Feldstein等的研究结果显示HepG2细胞虽为肿瘤细胞,但可以获得和肝细胞一样的模型效果。本实验参照C0等的研究,利用OA诱导HepG2细胞脂肪变性为体外模型,发现细胞内TG含量显著增高,HepG2细胞出现明显脂变。 　　
         PPAR-α是一种配体依赖的核转录因子,在肝脏中高度表达,PPAR-α缺乏或表达受抑,可引起一系列与肝内脂肪酸代谢有关的蛋白质、酶基因的转录水平降低,从而导致脂肪性肝病发生和发展,但其机制尚不十分明确。HO-1又称热休克蛋白32,研究认为HO-1的及其代谢血红素的产物均可发挥抗氧化应激作用,HO-1靶向性激活可以阻止NAFLD的发生及发展。还有学者在对PPAR-α基因敲除小鼠和野生型小鼠的肾脏缺血再灌注损伤研究中发现,PPAR-α可以通过诱导HO-1的表达来减轻肾脏缺血再灌注损伤程度田。但有关PPAR-α对其下游HO-1表达的影响在肝脏疾病领域的研究较少,尤其在NAFLD的发生及发展中的变化是怎样的,目前鲜见此方面的报道。 　　
         本实验显示,OA诱导HepG2细胞脂变时,PPAR-αmRNA和蛋白的表达明显下降,同时HO-1mRNA和蛋白的表达也显著降低,两者呈正相关。提示OA诱导HepG2细胞脂肪变性可能与其抑制PPAR-αmRNA和蛋白水平的表达,进而抑制HO-1的表达有关。为明确PPAR-α及其下游HO-1的表达在A诱导HepG2细胞脂肪变性中的作用,我们采用不同浓度的PPAR-α特异性激动剂FF进行了进一步研究。结果表明,随着FF作用浓度的增加,HepG2细胞脂肪变性程度逐渐减轻,而PPAR-α的mRNA及蛋白表达水平不断递增,同时观察到HO-1的表达水平同PPAR-α的变化相一致,两者呈正相关,提示PPAR-α对其下游HO-1表达的影响可能参与了OA诱导的HepG2细胞脂肪变性。 　　
         本研究证实NAFLD的形成可能同PPAR-α及其下游因子HO-1的表达被抑制相关,而激活PPAR-α则可以上调HO-1的表达,进而使肝细胞的脂肪变性程度减轻。 　　
         参考文献 　　
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