PNPLA3基因慢病毒载体及其过表达Huh-7细胞系的构建

　　非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)正在成为我国一个新的公共健康问题。PNPLA3基因I148M多态性与NAFLD密切相关,且此多态陆参与了NAFLD的疾病进展。但是,其在NAFLD发病中的具体生物机制目前尚不明确。本实验利用基因重组技术,成功构建了携带PNPLA3基因野生型和I148M突变型的慢病毒载体,并感染人肝癌细胞株Huh9细胞,建立了稳定过表达目的基因的细胞系,为深人研究PNPLA3基因的生物学功能提供了理想的细胞模型。 　　
　　一、资料与方法
　　1.主要材料与试剂:293T细胞、Huh-7细胞、慢病毒载体质粒pEGH、慢病毒包装质粒系统、转染试剂、感受态细胞等均购自上海思路迪公司。DMEM培养基购自美国Hyclone公司。胎牛血清购自杭州四季青公司。细胞培养器皿购自美国Corning公司。限制性内切酶、Kodplus缓冲液、DNA相对分子质量标准品、RNA提取及逆转录试剂盒等购自日本TaKaRa公司。引物合成由上海博尚公司完成。潮霉素-B购自南京生兴生物技术有限公司。Westernblot相关材and料与试剂、抗flag标签蛋白鼠单克隆抗体、抗3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体等购自北京碧云天公司。 　　
　　2.携带PNPLA3基因野生型载体质粒的构建:生长良好的Huh-7细胞,吸尽培养液,磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗两遍。Trizol法提取Huh-7细胞的总RNA。利用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板,引物A和引物B,反应体系为50ul:模板0.2ul,10×Kodplus缓冲溶液5ul,dNTP(2mmol/L)5ul,MgSO4(25mmol/L)2ul,上游引物(10umol/L)1.5ul,下游引物(10umol/L)1.5ul,双蒸水33.8ul,Kodplus1ul。PCR反应条件:94℃2min;94℃15s,56℃30s,68℃1min,30个循环;68℃9min;10℃保存。PCR产物经XbaI、BstBI双酶切后回收,连接至载体质粒pEGH。连接体系为10ul:pEGH3ul,PNPLA3(WT)/PNPLA3(I148M)2uL,双蒸水3uL,10×T4缓冲溶液1ul,RocheT4ligase1ul;连接反应条件为24℃2h。取5ul连接产物转化GeneHogs化学感受态细菌,挑选4个克隆培养过夜,抽提质粒,酶切并测序鉴定。 　　
　　3.携带PNPLA3基因I148M突变型载体质粒的构建:以PNPLA3基因野生型质粒为模板,分别以引物A和引物C、引物B和引物D为引物组合,反应体系同2,进行轮PCR。PCR反应条件:94℃2min,94℃15s,56℃30s,68℃1min,25个循环,68℃9min;10℃保存。以轮PCR产物为模板,以引物A和引物B进行第二轮PCR,反应体系和反应条件同轮。第二轮PCR产物经XbaI、BstBI双酶切,回收并连接至载体质粒。连接体系和反应条件同2。取5u1连接产物转化GeneHogs化学感受态细菌,挑选2个克隆培养过夜,抽提质粒进行酶切并测序鉴定。 　　
　　4.慢病毒表达质粒与包装质粒共转染293T细胞:选择生长良好的293T细胞,ˉ接种至10cm培养皿内,24h后按试剂说明书要求进行转染操作。每个培养皿加人载体质粒及包装质粒(含pRsv-REV、pMDlg-pRR和pMD2G)共12ug,3Dtransfectionreagent24ul
　　5.病毒收集:转染后,分别收集48h和72h细胞培养液上清液,4℃、1000r/min离心10min,上清液经0.45um滤膜过滤;4℃、2000r/min超速离心2h,弃上清液,DMEM重悬沉淀,20ul/管分装,测定滴度,-80℃保存。 　　
　　6.慢病毒感染Huh-7细胞:Huh-7细胞1.5×10的5次方个个/孔接种于6孔培养板内,12h后,每孔加慢病毒3.0×10的5次方IU)和polybrene(终浓度为6ug/ml),培养24h后换液,继续培养48h后观察绿色荧光,加入潮霉素-B(终浓度为500ug/ml)筛选,24h后换液。 　　
　　7.Westemblot检测PNPLA3蛋白过表达:6孔板中Huh-7细胞长至90%融合度时,吸尽培养液,PBS冲洗2遍,每孔加人细胞裂解液250ul,吹打混匀,细胞裂解液转移至1.5mlEP管中,100℃煮沸5min,测定蛋白浓度。配制12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶,每孔上样20ug,80V电泳20min,100V90min。电泳完毕,半干法转膜(聚偏氟乙烯膜),10V10min,12V20min。转膜完毕,封闭液封闭60min,洗膜,抗GAPDH抗体按1:5000、抗flag抗体按1:1000稀释,4℃孵育过夜,洗膜,加人第二抗体孵育2h,洗膜,显影。 　　

　　二、结果 　　

　　1.慢病毒载体质粒构建:总cDNA的PCR扩增产物电泳图显示,其长度为1443bp,与PNPLA3基因完整编码序列相符,表明扩增成功。质粒酶切结果显示,除了pEGH载体条带以外还可见PNPLA3基因完整编码序列的片段,符合预期。质粒测序结果与GenBank中标准序列一致,表明成功构建’漫病毒载体质粒。 　　

　　2.慢病毒包装:慢病毒包装系统共转染293T细胞,转染48h后荧光显微镜下观察,可见明显绿色荧光,表明慢病毒包装成功。 　　

　　3.Huh-7稳定株构建:慢病毒感染Huh-7细胞72h后,荧光显微镜显示绿色荧光蛋白阳性率>80%。经过潮霉素-B筛选,绿色荧光蛋白阳性率>95%,提示稳定株构建成功。 　　

　　4.Westemblot:应用Westernblot检测目的蛋白上携带的flag标签蛋白结果,与GAPDH比较,PNPLA3蛋白过表达,进一步证实稳定株构建成功。 　　

　　三、讨论 　　

　　慢病毒载体是一种高效的基因转移载体,可以将目的基因稳定整合人宿主细胞的基因组中,并且可以感染分裂细胞和非分裂细胞,具有转移基因片段容量大、目的基因表达时间长等优点。本实验运用此载体成功地将PNPLA3基因野生型和I148M突变型的编码序列整合人Huh-7细胞的基因组中,并建立稳定细胞株。 　　

　　PNPLA3属于PNPLA家族,其N端有一个保守的patatin结构域,因而具有脂肪水解和脂肪合成功能,在人类肝脏中表达水平高。PNPLA3是影响肝脏脂肪代谢的重要因子之一,其表达水平受膳食影响,空腹时低表达,进食时高表达。这些研究结果提示PNPLA3在能量代谢中起到重要作用。 　　

　　PNPLA3I148M多态性,是指一个单核苷酸多态性位点由C到G的改变(rs738409),导致PNPLA3蛋白第148位点上的氨基酸由异亮氨酸转变为蛋氨酸。大量研究已经证实,此多态性与NAFLD密切相关。多态性位点的存在不仅使肝脏脂肪含量升高,血清转氨酶水平升高,而且影响肝脏炎症的组织学进展。近的研究显示,此多态性还与酒精性肝病、病毒性肝炎甚至肝癌的疾病进展密切相关。 　　

　　分子结构模型表明,氨基酸的替换并没有改变PNPLA3活性中心的位置和方向,但是替换后蛋氨酸更长的侧链却延伸到活性中心,干扰了活性中心与底物的结合;这一结果解释了体外实验中突变型蛋白的脂解作用完全消失的现象。但突变型基因在小鼠肝脏的瞬时过表达引起了肝脏脂肪含量的升高,而野生型对肝脏脂肪含量和分布却没有明显的影响。这就提示氨基酸的替换导致的可能不仅仅是单纯的功能丧失。要揭示PNPLA3野生型及I148M突变型的作用机制,需要更多的分子实验和更好的细胞模型。 　　

　　本研究采用分子生物学技术和基因工程技术,分别构建携带PNPLA3基因野生型和I148M突变型的慢病毒载体感染Huh-7细胞,通过Westernblot检测Huh-7细胞中目的蛋白的过表达情况。终成功构建重组慢病毒载体;慢病毒有效感染Huh-7细胞,荧光显微镜观察显示感染有效率超过95%;目的蛋白在Huh-7细胞中成功过表达。这为进一步研究PNPLA3基因野生型和I148M突变型的生物学功能,以及它们在NAFLD和其他慢性肝病中的作用奠定了基础。 　　

　　参考文献 　　

　　1.中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组. 非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)[J].中华肝脏病杂志,2010,(3):163-166.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2010.03.002.
　　2.Romeo S,Kozlitina J,Xing C. Genetic variation in PNPLA3 confers susceptibility to nonalcoholic fatty liver disease[J].Nature Genetics,2008,(12):1461-1465.doi:10.1038/ng.257.
　　3.Rotman Y,Koh C,Zmuda JM. The association of genetic variability in patatin-like phospholipase domain-containing protein 3 (PNPLA3) with histological severity of nonalcoholic fatty liver disease[J].Hepatology,2010.894-903.
　　4.Sakuma T,Barry MA,Ikeda Y. Lentiviral vectors:basic to translational[J].Biochemical Journal,2012.603-618.
　　5.Wilson PA,Gardner SD,Lambie NM. Characterization of the human patatin-like phospholipase family[J].Journal of Lipid Research,2006.1940-1949.
　　6.Liu YM,Moldes M,Bastard JP. Adiponutrin:a new gene regulated by energy balance in human adipose tissue[J].Journal of Clinical Endocrinology and me[x]tabolism,2004.2684-2689.
　　7.Sookoian S,Pirola CJ. me[x]ta-analysis of the influence of I148M variant of patatin-like phospholipase domain containing 3 gene (PNPLA3) on the susceptibility and histological severity of nonalcoholic fatty liver disease[J].Hepatology,2011.1883-1894.
　　8.Trépo E,Gustot T,Degré D. Common polymorphism in the PNPLA3/adiponutrin gene confers higher risk of cirrhosis and liver damage in alcoholic liver disease[J].Journal of Hepatology,2011.906-912.
　　9.Trépo E,Pradat P,Potthoff A. Impact of patatin-like phospholipase-3 (rs738409 C》G) polymorphism on fibrosis progression and steatosis in chronic hepatitis C[J].Hepatology,2011.60-69.
　　10.Trepo E,Guyot E,Ganne-Carrie N. PNPLA3 (rs738409 C》G)is a common risk variant associated with hepatocellular carcinoma in alcoholic cirrhosis[J].Hepatology,2012.1307-1308.
　　11.He S,McPhaul C,Li JZ. A sequence variation (I148M) in PNPLA3 associated with nonalcoholic fatty liver disease disrupts triglyceride hydrolysis[J].Journal of Biological Chemistry,2010.6706-6715.