淋巴细胞功能相关抗原-3（CD58）在儿童期急性B淋巴细胞白血病近期疗效判断中的应用

作者：赵惠君,蒋黎敏,袁晓军,李莉,汤静燕,沈　　作者单位：上海交通大学医学院附属新华医院，上海儿童医学中心实验诊断中心，1血液肿瘤科，上海 200127

　　【摘要】本研究评估CD58在急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)近期疗效判断中的价值。应用四色流式细胞分析技术观察135例儿童期B-ALL患者CD58分子的表达特点;建立用CD58/CD10/CD34/CD19抗体组合检测B-ALL MRD的方案;结合CD58的表达情况和MRD监测结果分析CD58在B-ALL中的预后价值。结果表明: 135例B-ALL的平均CD58 MFI为113.08±63.33，15例正常骨髓的CD19+CD10+细胞的平均CD58 MFI为14.68±5.26，两者差异显著(P<0.01);51.9%(70/135)B-ALL患者的CD58分子强表达，可以用CD58为指标进行MRD检测;CD58/CD10/CD34/CD19抗体组合的有效频率仅次于TdT/CD10/CD34/CD19，为51.9%;CD58高表达组的MRD阳性率显著低于CD58低表达组(P<0.05)。结论： CD58可以作为B-ALL MRD检测的指标，此结果丰富了MRD检测的组合;CD58的高表达可以作为B-ALL预后较好的指标。
　　【关键词】 急性B淋巴细胞性白血病; CD58; 微小残留病; 淋巴细胞功能相关抗原

　　Prognostic Significance of Lymphocyte Function Associated Anti-gen-3 (CD58) in Childhood B Cell-Acute Lymphocytic Leukemia　XU Chong，ZHAO Hui-Jun，JIANG Li-Ming，YUAN Xiao-Jun，LI Li，TANG Jing-Yan， SHEN Li-Song　Laboratory Diagnostic Center，1Department of Hematology/Oncology，Shanghai Children Medical Center，Xinhua Hospital，Shanghai Jiaotong University Medical College，Shanghai 200127，China

　　Abstract This study was aimed to investigate the value of CD58 in evaluation of early therapeutic effect on childhood B-ALL. The ex[x]pression features of CD58 in 135 cases of childhood B-ALL were analyzed by four-color flow cytometry; MRD detection protocol for B-ALL using CD58/CD10/CD34/CD19 combination was established; the correlation between the ex[x]pression features of CD58 and MRD detection was analyzed for the early therapeutic response in childhood B-ALL. The results showed that the mean value of CD58 MFI in 135 cases of B-ALL was 113.08±63.33，which was significantly higher than that in 15 cases of normal bone marrow controls (14.68±5.26，P<0.01). In addition，CD58 was over expressed in 51.9% (70/135) of B-ALL patients，indicating that CD58 could be an effective marker in MRD detection. The CD58/CD10/CD34/CD19 was the second most effective combination next to TdT/CD10/CD34/CD19 in B-ALL MRD detection with flow cytometry. Meanwhile，the positive rate of MRD detection by flow cytometry was significantly lower in CD58 over ex[x]pression group (P<0.05). It is concluded that CD58 may be used as an indicator for detection of MRD in B-ALL patients，which would enriche the combination of MRD detection. The CD58 over ex[x]pression may be considered as a marker of a favorable prognosis in childhood B-ALL.

　　Key words B-ALL; CD58; minimal residual disease; lymphocyte function associated antigen

　　CD58又称淋巴细胞功能相关抗原-3(lymphocyte function-associated antigen-3，LFA-3)，分子量为28 kD，广泛表达于造血细胞和非造血细胞[1]。它是T细胞表面标志CD2的配体，两者同属免疫球蛋白超家族成员，细胞外结构域具有很高的同源性[2]。通过与CD2的特异性识别，CD58介导了T细胞和胸腺上皮细胞、抗原呈递细胞以及靶细胞之间的相互作用，因而在淋巴细胞的活化、再循环及效应功能(包括针对于肿瘤细胞的细胞毒性作用等)中起到重要作用[3，4]。但作为黏附分子，CD58可能在肿瘤的转移和浸润中起作用。研究表明，在不同的血液系统肿瘤中，CD58的表达与预后关系有所不同[5-8]。但以上研究都是以肿瘤细胞CD58的阳性百分率作为观察指标，并未从CD58在肿瘤细胞表面的表达量的角度给予关注。而且CD58在儿童急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)中的预后作用尚无明确报道。
　　本研究应用流式细胞术分析了CD58在B-ALL中的表达特点，建立了用CD58检测白血病微小残留(MRD)的方案，并从CD58在B-ALL细胞表面表达量的角度初步评价了CD58对B-ALL在早期疗效及预后判断中的意义。
　　材料和方法
　　病例

　　135例B-ALL患儿均为本院的住院患者。所有患者都经过FAB分型法及流式细胞术免疫分型法明确诊断。患者都用PVDL(泼尼松、长春新碱、柔红霉素和左旋门冬酰胺酶)方案进行诱导缓解治疗。在第1疗程结束、达到临床缓解后以及在以后的持续治疗过程中共有75例患者用多种抗体组合进行了微小残留病的监测。正常对照15例。
　　材料和仪器
　　单克隆抗体 CD58-FITC单克隆抗体购自法国Immunotech公司;CD10-PE单克隆抗体购自丹麦Dako公司;CD34-PerCP和CD19-APC单克隆抗体均购自美国Becton Dickinson公司。
　　仪器

　　流式细胞仪为FACSCalibur型(美国Becton Dickinson公司的产品)。
　　CD58在B-ALL中表达特点的观察

　　单个核细胞分离 将B-ALL初发患者的骨髓标本用Ficoll液(密度1.077±0.002 g/ml)分离单个核细胞，用PBSA(含0.2%牛血清白蛋白及0.2%叠氮钠的PBS)洗2遍，用PBSA悬浮。
　　细胞膜表面抗原染色
　　调节每管细胞数为1×106，用CD58-FITC，CD10-PE，CD34-PerCP和CD19-APC单克隆抗体按抗体说明书进行膜表面抗原标记，用PBS洗2遍，洗去未结合抗体，用多聚甲醛悬浮待用。
　　检测及分析

　　测定前先用标准荧光微球校准仪器。用CellQuest软件(version 3.2)进行收集。所有患者标本都用同一设定条件检测。结果用CellQuest软件(version 3.2)进行分析。用Sigma Plot软件进行统计作图。
　　微小残留监测

　　首先确定适合用CD58/CD10/CD34/CD19抗体组合进行MRD监测的病例。在CD58/CD10双参数图上，以白血病细胞分布在不同于正常细胞出现的区域且与正常细胞区域无重叠者确定为CD58/CD10/CD34/CD19抗体组合适用。
　　然后以适合用CD58/CD10/CD34/CD19抗体组合进行MRD监测的患者，其诱导缓解治疗结束后以及持续治疗过程中的骨髓标本经Ficoll液分离单个核细胞以后，用CD58/CD10/CD34/CD19抗体组合进行标记。其他抗体组合如TdT/CD10/CD34/CD19，CD38/CD10/CD34/CD19，CD45/CD10/CD34/CD19，CD66c/CD10/CD34/CD19和CD22/CD10/CD34/CD19检测MRD的方法见文献[9]所述。分析时，如果在初发白血病细胞出现的区域内仍有细胞存在，即判定为MRD阳性。以这些残存的细胞占骨髓单个核细胞总数的比例作为MRD的数值。
　　CD58对于B-ALL早期疗效及预后的意义的初步评估
　　将进行过MRD监测的B-ALL患儿分为CD58高表达和CD58低表达两组。其分组原则为：患儿CD58过强表达，以致B-ALL细胞在流式CD58和CD10双参数点图上与骨髓正常CD19+CD10+的细胞无重叠，明显区分开时，确认为CD58高表达组;而其余病例的B-ALL细胞在流式CD58和CD10双参数点图上与骨髓正常CD19+CD10+的细胞有重叠无法明显区分时，确认为CD58低表达组。用χ2检验分析这2组病例与MRD监测结果的关系。
　　结 果
　　CD58在B-ALL中的表达特点

　　B-ALL患者的白血病细胞CD58阳性率平均为9218%，中位数为98.82%(2.47%-99.99%)，887%的患者CD58表达率在80%以上。平均荧光强度(median fluorescent intensity，MFI)可以反映细胞膜表面或胞浆内的抗原表达量，因此本实验通过CD58 的MFI对B-ALL和正常骨髓中CD19+CD10+细胞膜表面的CD58表达量作比较(图1)。实验研究表明，135例B-ALL的平均CD58 MFI为113.08±63.33，15例正常骨髓的平均CD58 MFI为14.68±5.26，两者差异显著(P<0.01)。
　　用CD58/CD10/CD34/CD19抗体组合检测B-ALL MRD方法的建立
　　CD58在B-ALL患者骨髓中的表达量显著高于正常骨髓，如果白血病细胞与正常骨髓中CD19+CD10+细胞的CD58 MFI无重叠，即可作为MRD检测的有效指标。如图2所示，Ai-Aiii为正常骨髓细胞，在Ai中以R1选取单个核细胞;在Aii中以R2选取CD19+的单个核细胞;正常骨髓的CD19+单个核细胞在CD58和CD10双参数点图上的分布如Aiii所示，R3为正常B细胞所不会出现的区域，以“空白区”表示。“空白区”位置的设定是MRD检测的关键。
　　Bi，Bii和Biii 3例初诊时的B-ALL患者的白血病细胞分别分布在R3“空白区”中，并且与正常B细胞的分布范围无重叠，因此这3例患者可用CD58/CD10/CD34/CD19抗体组合进行MRD检测。Ci和Cii分别对应Bi和Bii，为2例患者经治疗达临床缓解时的MRD监测结果，在“空白区”中与初诊时白血病细胞分布的相同位置无残存细胞出现，MRD判为阴性结果。Ciii，“空白区”中与Biii所示初诊时白血病细胞分布相同位置仍有残留细胞出现，MRD判为阳性，经计算MRD结果为0.91%。
　　CD58在135例B-ALL MRD检测中的适用频率

　　如表1所示，在对135例B-ALL患者进行的MRD有效指标(即某指标在白血病细胞与正常骨髓细胞中CD19+CD10+细胞的MFI无重叠，可将白血病细胞和正常CD19+CD10+细胞明确区分的，则可作为MRD检测的有效指标)筛选中，CD58的有效频率(即CD58指标有效，可以用CD58组合进行MRD检测的患者例数在135例B-ALL患者中所占的比例)仅次于TdT，为51.9%，这在很大程度上丰富了MRD检测的组合。Table 1. Efficient frequency of CD58 in MRD detection in 135 cases of B-ALL(略)

　　CD58在B-ALL细胞表面表达量与MRD监测结果的关系
　　迄今为止，MRD的监测结果是预示白血病复发的可靠的依据[10]。本研究按CD58 MFI是否与正常骨髓细胞有重叠将75例已进行过MRD监测的病例分为CD58高表达和低表达2组，观察2组病例与MRD监测结果的关系。结果显示，CD58高表达组的MRD阳性率显著低于CD58低表达组(P<005)(表2)。这表明CD58高表达组的白血病复发风险较小。Table 2. CD58 ex[x]pression and results of MRD in B-ALL(略)

　　讨 论
　　在T细胞和靶细胞的黏附作用中，有3个淋巴细胞功能相关结构参与其中，分别是：T细胞膜表面的LFA-1(CD11a/CD18)和LFA-2(CD2)以及靶细胞膜表面的LFA-3(CD58)[2]。黏附分子CD58是CD2的配体，两者的结合不仅促进了细胞毒性T细胞(CTL)与靶细胞的结合，同时也为CTL活化与增殖提供了必要的信号。
　　已有研究表明，在Burkitt淋巴瘤和T淋巴细胞白血病中，CD58的表达减少是肿瘤细胞逃避CTL和NK细胞的杀伤的重要机制;CD58的高表达率应是疾病预后良好的标志[5，6]。Roux等[11]发现霍奇金淋巴瘤细胞表面的CD58分子脱落，造成血浆游离CD58参与竞争结合CTL表面CD2，从而抑制靶细胞与CTL结合以及T细胞活化，这可能是造成淋巴瘤细胞逃逸的重要机制。这些观点都支持LFA-2(CD2)-LFA-3(CD58)路径在机体抑制肿瘤机制中的积极作用。但也有研究者提出不同的观点。在慢性B淋巴细胞白血病中，CD58阳性的病例脾肿大的发生率较高，对病程发展更不利[8]。这也说明，作为黏附分子的CD58也可能在肿瘤细胞的转移和侵袭性中起作用。Oblakowski等[7]认为，对于髓细胞白血病，在机体抗肿瘤机制中起作用的是LFA-1(CD11a/CD18)和ICAM-1(CD54)黏附系统，而不是CD2-CD58系统。
　　但迄今为止，对于CD58的表达在B-ALL中的作用的研究尚少见。仅有Kebelmann-Betzing等[12]通过对10例复发的B-ALL患儿的研究指出，在复发的B-ALL患儿的白血病细胞中，CD58阳性率中位数为46%(1%-90%)，其中40%的病例CD58阳性细胞大于50%;而70%的病例CD54阳性细胞小于20%。作者据此认为，CD54的弱表达或阴性表达使CTL参与的免疫反应受损，这是B-ALL复发的机制之一。然而，该研究只是以CD58表达阳性细胞的百分比作为观察指标，并没有考虑CD58在B-ALL细胞表面表达的量在早期疗效及预后中可能起到的作用。
　　Chen等[13]用基因芯片技术筛选B-ALL 的MRD检测新指标时发现，在一些B-ALL中存在CD58 mRNA过强表达，CD58分子在B-ALL细胞表面过量表达的现象。但至今仍无CD58与B-ALL预后关系的明确报道。
　　本研究对135例B-ALL的CD58表达特点进行了分析，结果显示88.7%的患者CD58表达率在80%以上，CD58的广泛高表达率成为儿童期B-ALL的特点。因此，仅从CD58的阳性百分率来评估CD58在儿童期B-ALL早期疗效中的作用是明显不够的，也是不妥当的。本研究同时发现，在CD58广泛高表达的背后还存在着该蛋白分子表达量的差异，而CD58表达量的差异则可能存在着造成预后不同的潜在的可能性。
　　研究结果显示，135例B-ALL中CD58蛋白分子的总体表达强度显著高于正常骨髓中的CD19+CD10+细胞。51.9%(70/135)B-ALL患者的CD58分子过强表达，CD58 MFI与正常骨髓细胞MFI无重叠。借此可以用CD58/CD10/CD34/CD19进行B-ALL的MRD检测，从而丰富了MRD检测的抗体组合，进一步提高了MRD的检出率。
　　MRD监测结果目前仍是预示白血病复发可靠的判断依据[10]。本研究结合CD58的表达水平与MRD监测结果初步评估了CD58在B-ALL预后判断中的价值，特别是近期疗效判断中的价值。研究结果显示，CD58高表达的患者中MRD为阳性的患者比例显著低于CD58低水平表达的患者，即CD58高表达的患儿的白血病复发风险显著低于CD58低表达者。其机制可能是白血病细胞CD58的高表达使其增加了与CTL表面的CD2分子的作用机会，LFA-2(CD2)-LFA-3(CD58)黏附系统促进了CTL与靶细胞的相互作用，在机体抗肿瘤效应中起了积极作用。因此，CD58的过强表达可以作为B-ALL预后较好的指标。
　　对于CD58高表达所致的较好的近期疗效，其确切机理仍有待于进一步的研究来阐明。
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