猴痘病毒快速精检测方法_技术前沿_医疗器械资讯-3618医疗器械网

猴痘是由猴痘病毒（MPXV）引起的人畜共患病，与天花病毒（VARV）、牛痘病毒（CPV）和痘苗病毒（VACV）同属痘病毒科正痘病毒属。自20世纪80年代在世界范围内天花后，MPXV成为人类关注的正痘病毒。由于正痘病毒属表面蛋白具有较高的同源性（>90%），以VACV或改良牛痘病毒为基础的天花疫苗产生的中和抗体可以持续数十年，对猴痘提供约85%的交叉保护作用。

然而，自从世卫组织1980年宣布消灭天花后，大多数国家终止了常规的天花疫苗接种，导致全球范围内相当一部分人群对猴痘病毒缺乏免疫力。此外，在接种天花疫苗的人群中，其保护作用也会随着时间的推移而缓慢衰减，从而增加了感染猴痘病毒的风险。
鉴于国内的猴痘疫情和快速增加的猴痘病例，需要在发病早期快速甄别出阳性病例，并指导后续的防治策略和疫情防控。猴痘病毒的检测可通过病毒培养和分离鉴定、电子显微镜、聚合酶链反应（PCR）、免疫荧光检测等技术方法进行。猴痘病毒培养和分离鉴定为确证试验，但猴痘的培养只能在生物安全III级实验室由受过相关安全程序培训的具有相应准入资质、并具有丰富病毒分离培养经验的人员进行，但病毒分离阳性率低，需耗时数天。不建议将病毒分离作为常规检测和诊断程序。电子显微镜可用于评估样本中潜在的猴痘病毒。但电子显微镜需要专门的专业技术人员，技术要求较高，且对样本中病毒颗粒的浓度要求较高。
因此，由于所需的高技术技能和设施，这种方法并不常规用于猴痘病毒的检测。其他检测方法，如血清中和试验、凝胶沉淀、免疫荧光试验等，虽然也具有一定的诊断价值，但操作复杂，耗时长，不适合作为猴痘病毒的常规实验室检测。
目前，聚合酶链反应（PCR）检测是的猴痘检测方法，其中实时PCR（qPCR）技术是猴痘病毒检测和分型有效的方法。该方法的优点是灵敏度高、通量大。但目前针对猴痘的PCR检测试剂存在检测时间长、稳定性差、操作繁琐、与其它正痘病毒存在交叉反应的风险等缺陷。而且，猴痘病毒感染潜伏期较长，实时荧光定量PCR分子诊断方法对样品采集、实验操作人员及配套检测设备有较高要求，无法保证快速鉴别感染者。目前没有可以广泛使用的商业 PCR检测试剂盒。因此，针对猴痘病毒有效的快速、灵敏、精的检测方法亟需建立。

该研究建立了一种快速精的猴痘病毒检测方法，通过将等温扩增（RPA）与CRISPR-Cas12a的检测体系联合，可以实现猴痘病毒DNA在30分钟内的快速检测，检测灵敏度1个拷贝数，同时能够精区分其他正痘病毒以及猴痘病毒，具有良好的实用价值。
研究团队首先设计了两个crRNA的检测体系池，其中一组靶向正痘病毒（包括痘苗病毒、天花、牛痘以及猴痘）的保守区D6R和E9L，可以检测所有的正痘病毒；另外一组靶向猴痘病毒特有的区域N3R和N4R。通过对crRNA的设计和筛选，建立了基于CRISPR/Cas12a的荧光报告体系。

进一步针对选择的crRNA，分别检测不同拷贝数的质粒模板以及病毒DNA模板，观察到CRISPR-Cas12a单独检测体系的检测限约为10 ⁸ 拷贝数，不同crRNA的联合可以将检测限提高到10 ⁷ 拷贝数，同时实现了正痘病毒与猴痘病毒的区分。并且为了实现低检测限，研究团队团队将等温扩增（RPA）与CRISPR-Cas12a的检测体系联合，能够达到1个拷贝的低检测限，大大提高了检测体系的灵敏度。

为了验证检测体系实际应用的可靠性与准确性，针对中国大陆第一例猴痘病例的拭子样本进行了检测。该体系同样实现了1个拷贝数的低检测限，并且成功的在病人咽拭子，鼻拭子以及水泡拭子中检测到了猴痘病毒的DNA，证实了体系应用的可靠性。同时针对猴痘病毒核酸检测试剂国家参考品的检测，阴性参考品中未检测到猴痘病毒的DNA，进一步证实了检测体系的准确性。

为了提高检测效率，进一步优化反应体系到单管中，大大的缩短了检测时间以及操作步骤。在提取得到待测DNA后，15分钟到30分钟内即可实现样本的快速检测，且灵敏度高达1个拷贝数。相比于传统荧光PCR的2小时，大大缩短了检测时间，提高了检测的灵敏度。

综上所述，该研究建立了猴痘病毒的快速精的检测方法，通过crRNA的筛选建立了一套CRISPR检测体系，并联合等温扩增实现了猴痘病毒的快速、灵敏的精检测。为猴痘病毒的快速诊断提供了有力的技术支持。

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