柯萨奇B3病毒VP1基因在原核中的表达及其临床意义

【摘要】  目的：研究柯萨奇B3病毒(CVB3)VP1基因在大肠杆菌中的表达及其临床意义。方法：将柯萨奇B3病毒中国分离株VP1基因克隆入PQE30载体，转导入大肠杆菌(Ml5)中，使CVB3的VP1基因在大肠杆菌中得到稳定的表达，采用NAT亲和方法纯化，间接ELISA方法做免疫学活性鉴定。结果：表达的VP1产物与抗柯萨奇B3病毒的兔抗CVB3(多克隆抗体)血清产生较强的免疫反应，与天然的CVB3蛋白抗原(病毒组织培养抗原)的抗原性近似。应用无关兔抗体对照呈阴性反应。应用表达的VP1产物作为抗原，对临床急性病毒性心肌炎患者血清进行了特异性IgM酶联免疫吸附试验检测，其结果与组织培养的CVB3制备的细胞蛋白抗原对上述患者血清的特异性IgM检测结果基本一致。结论：采用基因工程方法制备出的CVB3VP1蛋白抗原产量高，纯化后免疫反应原性基本没有变化。试用表达CVB3的VP1基因工程抗原代替目前实验用有感染危险的病毒培养抗原的方法，快速、特异地检出CVB3的感染，为急性心肌炎的早期诊断和及时的临床治疗提供可靠的实验室诊断指标。

【关键词】  柯萨奇B3病毒(CVB3) VP1基因 基因表达

　　ex[x]pression of coxsackievirus group B3 gene fragment encoding VP1 in procaryon and clinical significance

　　BI ShengLi,QMeng,CHEN TingYou,SONG YuGuo.

　　Jilin Medical College of Beihua University,Jilin 132013,China

　　［Abstract］  ob[x]jective:To study the ex[x]pression of coxsackievirus group B3 gene fragment encoding VP1 in procaryon and to explore its application.Methods:Stablie ex[x]pression of VP1 gene of CVB3 in E.coli was obtained.The expressed protein was purified by NAT chromatography and its immunoactivity was identified by indirect ELISA.Results:The expressed product of VP1,similar to native protein antigen of CVB3,could strong bind with the mouse's antibody serum against CVB3(polyclonal antibody).Irrelevant monoclonal antibody as contrast presents negative activity. Using the expressed VP1 product,we have had a special IgM ELISA for the patient's serum of the clinical acute viral myocarditis.The result was same with the cellular protein antigens of the tissuecultivated CVB3.Conclusion:The protein antigen CVB3VP1 which is obtained by the method of gene engineering has character of high product, and its immunoactivity after being purified was basically unchanged. At present, this kind of antigen is difficult to be obtained from the viral cullture medium and a potent hazard for being infected by this virus may take place in such manipulateion. By the method of gene engineering we can obtain antigenic VP1 of CVB3 and use as immuneogen for the detection of serum antibody,by which to provide reliable test reference for the earlystage diagnosis and clinical therapy of the acute myocarditis.

    ［Key words］Coxsackievirus B3(CVB3)；VP1 gene；Gene ex[x]pression

　　柯萨奇病毒(Coxsackievirus)于1958年在美国柯萨奇地区分离出，属小RNA病毒，可引起从上呼吸道到中枢神经系统感染的许多疾病[1,2]。该病毒分为A、B两组，其中柯萨奇B组病毒(Coxsackievirus group B，CVB)属于小RNA病毒科的肠道病毒属，有6个血清型，是引起人类病毒性心肌炎、无菌性脑膜炎和新生儿全身性感染等疾病的主要病原，可在世界各地散发或暴发流行，近年来其发病呈显著上升趋势。研究表明，柯萨奇B组病毒VP1基因是能诱导机体产生体液免疫的优势抗原，病毒感染后可以很快诱导人体产生特异性IgM抗体[3,4]。目前临床实验用的病毒培养抗原方法，存在着制备困难、产量低、易感染等缺点，因此，寻求安全、高效、快速的检测手段就显得尤为重要。
   
　　采用柯萨奇病毒B3的中国分离株，逆转录其VP1基因克隆入原核表达载体PQE30，表达柯萨奇病毒B3的VP1结构蛋白，并用纯化表达产物对临床感染性病毒性心肌炎急性期病人血清初步检测特异性IgM抗体，为建立更加灵敏、特异的诊断方法和柯萨奇病毒基因表达蛋白疫苗研究打下基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  主要仪器设备及材料

　　PCR仪；酶联仪；摇床；层析柱；镍柱亲和层析树脂等。

　　1.1.2  主要试剂

　　感受态大肠杆菌M15（PREP4）(含抗KN基因)及JMl09DE3由中国人民解放军军事医学科学院王全立教授赠送；PQE30(Amp+)及PGEMT(Amp+)载体质粒购置Promega公司；柯萨奇B3病毒培养抗原购于北京现代高达生物技术有限责任公司；柯萨奇病毒兔抗人IgM抗体制备于军事医学科学院；逆转录酶、T4连接酶、逆转录随机引物Olig(dt)、Taq DNA聚合酶购于Promega公司；限制性内切酶PSTI和Bam HI购于大连六和通生物有限公司；PCR引物由上海生物工程公司合成：P2450(+)CGC GGA TCC GGC CCA GTG GAA GAC GCG ATA；P3300(-)AAA ACT GCA GTG CGC CCG TAT TTG TCAT。扩增产物为完整的VP1基因(850 bp)；血清标本：收集于吉林市儿童医院急性病毒性心肌炎患者，5～14岁；抗人IgMHRP购自北京高达公司；Tris碱、尿素等均购于北京化工厂；酶联聚苯乙烯微孔板购于深圳立基公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  RNA提取

　　用Gibcobrl公司生产的TRIZOL试剂提取柯萨奇病毒B3细胞总RNA [5]。RNA模板重悬于10 μl无RNase水中-70℃备用。

　　1.2.2  逆转录

　　用高压灭菌200 μl离心管加入1 μl Oligo(dt)(500 μg／m1)，4 μl总RNA(约5 μg)，1 μl 10 mmol/L dNTP和1％DEPC水7 μl混匀65℃ 5分钟，冰浴1分钟离心。再加入4 μl 5×friststrand Buffer，2 μl 0.1 ml DTT，混匀42℃ 2分钟。再加入1 μl Rnase OUT(Supersc[x]ript)42℃ 5分钟，然后移入70℃水浴15分钟灭活(总体积20 μl)。

　　1.2.3  扩增

　　用高压灭菌200 μl离心管加入2 μl逆转录产物，5 μl×PCR Buffer，1.5 μl 50 mmol/L MgCl2，1 μl 20 mm dNTPs，上、下游引物10 μmol/L各1 μl，Taq DNA聚合酶0.4 μl，38.1 μl去离水混匀，94℃ 2分钟,94℃ 40秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟，循环32次。产物于1.2％琼脂扩凝胶电泳，切下850 bp目的基因片段，用DNA凝胶回收试剂(Promega)回收，电泳鉴定。后目的DNA溶于10 μl灭菌水中备用。

　　1.2.4  T载体连接转菌，菌体培养，测序

　　用高压后200 μl离心管加入1 μl 10×1 μl连接Buffer，1 μl T4连接酶，1 μl PGEMT载体，7 μl目的DNA置4℃过夜。连接后PCR电泳鉴定。用另一离心管取5 μl连接产物转菌JM109(DE3)，涂平板培养基(Amp+、Xgar/IPTG)过夜培养，挑阳性菌落PCR鉴定和培养3 ml，菌体送大连六和通生物工程有限公司测序。

　　1.2.5  cDNA克隆

　　挑选转入目的基因的JMl09(DE3)阳性菌落用LB培养基(Amp+)培养3 ml、37℃培养14小时。OD600为1时回收菌体，提取T质粒。用Bam HI和PSTI酶切后经1.2％琼脂扩电泳，回收850 bp段；连接克隆入PQE30载体中，克隆方法参照文献[6]。连接后转入感受态大肠杆菌M15(PREP4)(Amp+)；涂抗Amp和抗KNLB琼脂平板培养基培养16小时，挑选阳性菌落经PCR鉴定，抗Amp和抗KN的LB培养基培养3 ml OD600=1时，提取质粒酶切鉴定和保存菌种备表达用。

　　1.2.6  CVB3 VP1基因在大肠杆菌中表达

　　以重组阳性菌经抗Amp和抗KN的抗LB培养基中培养，IPTG诱导表达，以未加IPTG菌体作对照，回收菌体,经SDSPAGE电泳鉴定。鉴定阳性菌按1:50放大培养于抗Amp和抗KN的LB培养基500 ml，37℃培养7小时，OD600为0.5时加入0.1％1mol/L IPTG 37℃诱导表达5小时，细菌离心，沉淀用缓冲液(10 mmol/L TrisHCl，pH8.0)重悬细菌，超声破碎菌体，离心弃上清，沉淀用缓冲液(10 mmol/L TrisHCl，pH8.0／8 mol/L尿素)溶解沉淀，经镍柱亲和层析纯化、SDSPAGE电泳鉴定，留产品峰备用。

　　1.2.7  VP1表达产物的鉴定

　　①通过Minipreparation系统作SDSPAGE免疫印迹法对表达产物进行鉴定。样品加入4.5％浓缩和12％的分离胶进行电泳。将胶分成两份，一份用考马斯亮蓝R250染色30分钟。经甲醇一冰醋酸脱色后观察蛋白表达条带。一份则进行免疫印迹分析[7]，将蛋白泳带电转至硝基纤维膜上。条件为240 mA转印50分钟，膜用PBST(0.5％Tween20)洗2次，经1％脱脂奶粉室温封闭1小时，再将膜分成两份，分别加入抗CVB3多抗和无关单抗37℃孵育2小时，PBST(0.5％Tween20)洗5次，加入酶标羊抗兔IgGHRP，室温摇动孵育2小时后用PBST(0.5％Tween20)洗5次，用ADP底物显色。②回收表达目的蛋白包被聚苯乙烯微孔板，用间接ELISA对临床80例急性心肌炎病人的血清进行检测。

　　2  结  果

　　2.1  CVB3 VP1蛋白基因表达载体的构建

　　通过逆转录PCR合成扩增的CVB3VP1 cDNA，经1.2％的琼脂糖凝胶电泳，分析出现850 bp大小的片段，见图1，应用Promega公司生产的DNA凝胶纯化试剂盒回收目的DNA，回收的目的片段克隆入T载体中，增菌测序正向一个反应和Michael Lindberg等报道CVB3 cDNA序列符合率达92.9％(测一个循环591 bp，错误或突变碱基42个，占测序总碱基的7.1%，见图2)[8]。再经Bam HI和Pst I消化回收目的片段，见图1，克隆入PQE30载体中，增菌、表达、电泳鉴定得到目的基因表达，见图3。

　　2.2  SDSPAGE电泳对VP1基因表达产物的鉴定分析

　　阳性菌按1∶50用500 ml LB(Amp+、KN+)培养基培养至OD600为0.5时取出2 ml不加IPTG诱导，剩下菌体加0.1％的IPTG继续培养5小时，细菌回收变性，经SDSPAGE电泳,见图3。诱导管细菌，在约28 kD的位置上可以观察到明显的VP1蛋白表达条带，而未诱导细菌只有正常的菌体条带。纯化后以免疫印迹法可以在分子量约28 kD处有明显的反应条带，见图4，与病毒培养抗原反应近似，其分子量较小(文献报道33 kD)，因为不同的作者报道的CVB3基因核苷酸序列均存在差异，也可能是测序错误、碱基突变或是柯萨奇病毒中国株与美国株的基因差别[810]。

　　2.3  用CⅦ3免疫兔血清对VP1的鉴定  克隆表达的产物分别经
　　Minipreparation电泳转移系统将蛋白带转移到硝基纤维膜上，用CVB3的免疫兔血清(多抗)对表达的VP1蛋白进行特异性免疫反应，并用无关兔抗作对照。从结果可以观察到，CVB3免疫兔血清(多抗)与CVB3VP1蛋白和病毒组织培养抗原都产生特异性结合，而无关兔抗对照未出现特异性结合条带。

　　2.4  用表达CVB3VP1蛋白检测急性心肌病人血清的IgM抗体

　　2.4.1  对80例急性病毒性心肌炎患者的血清同时用VP1表达抗原和病毒培养分别检测CVB3特异性IgM。VP1表达抗原检出阳性标本28例，阳性率35％；病毒培养抗原检出阳性标本26例，阳性率32.5％，与国内报道1 770例病毒性心肌炎患者双份血清CVB3中和抗体阳性率36％的结果近似[3]。

　　2.4.2  表1为结果(OD值)配对资料t检验。表1  两种抗原检测OD值的统计学分析（略）

　　3  讨  论

    柯萨奇病毒是1958年在美国柯萨奇地区分离出而命名的，属小RNA病毒，该病毒分为A、B两组，其中柯萨奇B组病毒属于小RNA病毒科的肠道病毒属，有6个血清型，其基因组为正链RNA，全长为7 400个碱基，基因组除了5’和3’未编的非编码区外，中间为一个开放读码的编码区(P1、P2和P3区)[1,2]。其中P1区接近于基因组5’未端，编码病毒主要结构蛋白，排列顺序为VP4、VP2、VP3、VP1，它们构成20面体病毒壳粒[11,12]。柯萨奇病毒被发现至少有5个中和抗原决定簇[13]，但对其抗原决定簇的分布未见更多的报道。

    据文献报道，病毒组织培养的CVB3病毒抗原经过浓缩制备[14]，免疫印迹法与CVB3免疫的兔血清进行特异反应，可以观察到VP1(31 kD)处蛋白产生明显的反应带，而与VP2(31 kD)、VP3(29 kD)、VP4(8 kD)反应却很难看到，表明在CVB3的结构蛋白中，VP1可以使家兔产生很强的特异性抗体，而针对CVB3的VP2、VP3、VP4几个蛋白产生的抗体很弱或缺失。此现象表明VP1是能诱导抗体产生体液免疫的优势抗原。此外，Michael等[15]利用点突变证实VP1(Thrl29)决定着野生CVB的表型。Wemer等在试图表达CVB3结构蛋白时发现，VP2、VP3和VP4均表现出较稳定的表达，但加入VP1基因后，在大肠杆菌中的表达均不稳定，而在单独对VP1基因进行融合表达时也只能产生极低的表达量[16]。同样文献[17]中提到，研究Poliovirus I型病毒蛋白时也发现，在大肠杆菌中VP1基因的表达产物非常不稳定。推测其原因可能为：肠道病毒VP1基因中含有一段区域对大肠杆菌蛋白酶非常敏感；VP1基因中一段信号肽的存在可导致转录或翻译过程中使VP1断裂[16]。依据上述研究结果，我们在研究中选用原核高效表达系统中PQE30载体质粒。该载体含有T5 Lac启动子，它包括T5启动子及Lac操纵子，而且在转录的起始基因后紧接着有6个组氨酸基因融合表达于VP1基因中，从而使VP1基因表达蛋白便于分离纯化。同时配用含抗KN基因的M15（PREP4）作宿主菌，PREP4可以表达足够量的Lac抑制子，以减少基础靶基因的表达，同时PREP4可以增加细菌对含有毒性的抗原蛋白质粒的耐受，使不稳定态质粒趋于稳定。我们通过此方法表达的VP1与病毒组织培养组相比，其产量和稳定性均较理想，而且其抗原性与组织培养制备的病毒抗原性相似。

    此外，柯萨奇B组病毒是引起人类病毒性心肌炎、无菌性脑膜炎和新生儿全身性感染等疾病的主要病原。柯萨奇B组病毒感染在儿童致死率较高，尤其是急性心肌炎患者。由于该病毒分离所需的时间长，易感染，中和滴定又需双份血，而免疫印迹等检测方法又较慢，因此临床急需快速、安全、准确的特异性检测方法[18]。我们在实验中用CVB3VP1表达蛋白对80例儿童病毒性心肌炎患者的血清标本进行了病毒特异性IgM酶联免疫吸附试验(ELISA)，间接检测证实，柯萨奇B组病毒在引起人群感染后，在急性期诱导的IgM抗体是针对病毒的VP1蛋白抗原。因此利用表达的CVB3基因VP1蛋白做为抗原，用ELISA方法检测病毒性心肌炎病人血清中柯萨奇IgM(COXIgM)抗体，结果表明，基因表达抗原和病毒组织培养抗原特异性近似，且比病毒组织培养抗原灵敏度高，其阳性率更接近文献报道。此外，由于柯萨奇B组病毒6个血清型之间有较大的氨基酸序列同源性(75％)[19]，因此各型交叉抗原决定簇的存在可诱导宿主产生组特异性抗体，而B组柯萨奇病毒的血清中和抗体对A组柯萨奇病毒仅有弱的交叉反应，对脊髓灰质炎病毒I型没有交叉反应[16]。所以用柯萨奇B3VP1基因表达产物可以对柯萨奇病毒6个血清型的IgM抗体进行同步检测。对于表达的VP1蛋白的血清学反应特点我们将做进一步深入研究。

    总之，基因工程表达的抗原与组织培养制备的病毒抗原相比较，它具有制备快、产量高、无感染性且易于推广等优点，而且对以后的柯萨奇病毒IgM抗体检测酶联诊断试剂和病毒疫苗的研制提供基础。

 

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